[发明专利]一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

固定金属离子亲和色谱（IMAC）是近30年来发展起来的一种新型高效的蛋白质亲和分离技术，它主要通过材料表面的配基螯合铜、镍、钴或锌离子，利用蛋白质表面的一些氨基酸残基，如组氨酸、色氨酸或半胱氨酸能和这些离子发生较强的配位作用从而实现分离蛋白的目的。和其他蛋白纯化的方法相比，IMAC技术具有配基稳定性高、可重复使用且再生成本低、对目标蛋白选择性好且吸附量大、吸附与洗脱条件温和不影响蛋白活性等优点，尤其对带有6个组氨酸标签融合蛋白的分离纯化具有很好的效果。因此该技术逐渐成为了蛋白质分离纯化领域最有效、应用最广的技术之一。

目前的IMAC多采用传统的柱层析技术，仍然具有以下的缺点：样品需要预处理去除固体颗粒以防堵塞层析柱，分离过程操作繁琐、耗时长、成本高，此外存在扩散阻力导致分离效率下降。近年来快速发展的磁性亲和纳米技术给蛋白的分离纯化带来了革命性的发展，其特有的超顺磁特性简化了固液相分离过程，省去离心、过滤等繁杂的操作。纳米尺寸的粒径提供了极大的比表面积，提升目的蛋白的吸附量。在固定化酶研究领域，磁性亲和纳米材料可以作为载体实现酶的一步纯化固定化，简化了固定化酶制备过程。此外，将酶固定在磁性的材料上，在应用的过程中可以通过磁分离将催化剂从反应液中迅速分离，简化连续操作过程，节省成本。

虽然现有技术中已公开了一种用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性亲和磁珠，但是这种材料的制备过程复杂，需要多步化学的修饰过程，此外，商品化的产品价格较高，导致实际应用并不广泛。

近年来，多巴胺作为一种仿生粘附物质受到了密切的关注。研究发现多巴胺在弱碱性条件下能自聚形成聚多巴胺并包裹在几乎任何材料的表面。此外，在多巴胺自聚的同时，其所含有的邻苯二酚基团能与金属离子形成稳定的络合物。在生物技术领域，组氨酸标签融合蛋白系统的应用更加广泛，而到目前为止都还没出现将多巴胺用于组氨酸标签蛋白纯化的相关研究。并且，在组氨酸标签蛋白的固定化领域，到目前为止也还没有出现一种可实现对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化的简单的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用，从而解决现有技术中的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性亲和材料制备过程复杂，产品价格较高的缺陷，以及现有技术中缺少一种简单即可实现对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒，包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面螯合有镍离子。

所述磁性亲和纳米颗粒的粒径为200-300纳米。其中，四氧化三铁纳米颗粒的粒径大约为150-250纳米，聚多巴胺涂层包裹于四氧化三铁纳米颗粒外部，其厚度在25纳米左右。

根据本发明所提供的磁性亲和纳米颗粒具有较大的比表面积，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；利用四氧化三铁纳米颗粒超顺磁的特性可简化蛋白分离纯化以及固定化的流程，同时可简化固定化酶后续使用的流程；利用聚多巴胺富有的邻苯二酚基团螯合镍离子，可实现对组氨酸标签蛋白的特异性结合。

本发明中四氧化三铁纳米颗粒优选的制备方法如下：将氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和乙二醇按照摩尔比1：0:17：36.5：89.5混合，搅拌溶解后，加热至200℃，反应12小时，冷却后通过磁分离，并用乙醇和水去清洗得到四氧化三铁纳米颗粒。

本发明中的磁性亲和纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：1）提供Tris-HCl缓冲液配置多巴胺溶液，加入四氧化三铁纳米颗粒，搅拌，通过磁分离得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；2）提供镍离子溶液，将步骤1）中制备得到的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒分散在所述镍离子溶液中，搅拌，通过磁分离获得所述磁性亲和纳米颗粒。

优选地，步骤1）中所述多巴胺溶液的浓度为0.1-5mg/mL，加入所述四氧化三铁纳米颗粒的浓度为0.5-5mg/mL（优选1mg/mL），反应时间为6-12小时，步骤2）中所述镍离子溶液的镍离子浓度20-200mM（优选100mM），加入聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒浓度为0.5-5mg/mL（优选1mg/mL），搅拌时间为1-6h。