[发明专利]恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别提供了一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法。

背景技术

恶臭假单胞菌在自然界中普遍存在，是一种能够去除环境污染的环保微生物菌剂。美国、日本等国家已将该菌大批量生产制成产品经销到世界各国。为了增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来细菌的破坏，需要尽快建立环保微生物菌剂中恶臭假单胞菌检验方法。 

    目前，只有形态学鉴定和生化鉴定两种方法检测恶臭假单胞菌，而上述两种检测方法的结果均有很大的不确定性。

    因此，如何研发一种新的检测恶臭假单胞菌的方法，成为人们亟待解决的问题。

发明内容                                       

鉴于此，本发明的目的在于提供一种恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法，其通过采用PCR方法进行恶臭假单胞菌的基因片段检测，该检测方法不仅更加灵活，而且检测结果准确度高。

本发明一方面提供了恶臭假单胞菌的PCR检测用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

序列1：5' -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3'

序列2：5' -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3'

本发明另一方面提供了恶臭假单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）将上述恶臭假单胞菌的PCR检测用引物、待检菌液的DNA模板与PCR扩增用的含Mg²⁺的PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶混合，配制得PCR反应体系；

2）将上述的PCR反应体系置于PCR仪上，按照预定扩增条件进行扩增；

3）扩增结束后，利用电泳检测扩增片段从而断定结构。

优选，所述扩增条件为：94 ℃预变性1min；94 ℃变性15s，61℃退火15s，72 ℃延伸15s，进行30个循环；72 ℃延伸5min。

进一步优选，所述电泳检测为凝胶电泳检测。

进一步优选，所述凝胶电泳检测具体为：3～5V/cm恒压电泳，电泳50～60min

本发明提供的恶臭假单胞菌的PCR检测用引物及检测方法，采用PCR方法进行恶臭假单胞菌的基因片段检测，检测结果的准确度更高，检测方法更加灵敏，仅需要普通的PCR仪和电泳仪就可以达到检测的目的，而且仅用2-3小时就可以出具检测结果。

附图说明

图1为特异性确定检测的电泳图；

图2为敏感性确定检测的电泳图；

图3、图4和图5为29批恶臭假单胞菌的样品检测电泳图。

具体实施方式

 下面以具体的实施例对本发明进行进一步的解释，但并不用于限制本发明的保护范围。

实施例1 

引物的设计：

在Gengbank上查阅恶臭假单胞菌全基因序列，设计针对恶臭假单胞菌保守基因设计的特异性引物，其具体核苷酸序列为：

序列1：5' -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3'

序列2：5' -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3'

扩增恶臭假单胞菌目的基因片段为161bp。

实施例2

待检菌液的DNA模板提取：

1）以无菌操作取1g（mL）样品加入到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃培养24h。取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照。 

2）挑取平板上1-3个单菌落转营养肉汤35±1℃恒温培养箱内增菌培养18h～24h。

3）细菌基因组DNA的提取

取上述培养的菌液200ul，使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行，提取得到细菌基因组DNA。

实施例3

PCR扩增方法的建立：

1）PCR反应体系的配制：具体的成分配制见表1，

表1

同时设阴性对照和阳性对照。

2）PCR反应条件：

将上述配制好的PCR反应液小管，放入PCR仪中，反应条件：94 ℃预变性1min；94 ℃变性15s，61℃退火15s，72 ℃延伸15s，进行30个循环；72 ℃延伸5min。 

实施例4