[发明专利]大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒

说明书

 

一、技术领域

本发明提供一种大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒，属于生物技术领域。

二、背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）O157:H7是重要的食源性病原菌，能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染。中国已将大肠杆菌O157:H7列为21世纪可能对国人健康有重大影响的12种病原微生物之一，对人的致病力强，感染剂量低，感染载体含菌量达l0个/g以上即可引起感染。病菌侵入人体后，可以引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症。大肠杆菌O157:H7不仅关乎食品安全，而且与医疗和公共卫生问题密切相关。为了及时有效的监控未来可能的爆发感染，建立敏感、特异和可靠的技术用于快速而选择性的检测大肠杆菌O157:H7是极其必要的。

当前，许多报道尝试研制更适合的方法检测大肠杆菌O157:H7。传统的培养鉴定技术使用选择性培养基或者显色平板检测大肠杆菌O157:H7，但是这种方法费时，费力，准确性差。PCR技术已经被广泛应用各检测领域，发挥着不可忽视的作用。但是，运用PCR技术检测大肠杆菌O157:H7最大的障碍是如何选择唯一特异的标签基因建立方法。许多学者选用志贺毒素基因stx1和stx2、uidA、eae、fimA、rfbE和fliC鉴定大肠杆菌O157:H7，这些基因虽然在一定程度上提供了某些鉴定信息，但是大部分基因不是大肠杆菌O157:H7独有的基因，不能直接判定为大肠杆菌O157:H7。因此，选用更加特异而稳定的基因鉴定大肠杆菌O157:H7，建立快速检测技术，更加有意义和必要性。

前期研究工作中，通过对已有大肠杆菌O157:H7全基因组序列生物信息学，比对分析，发现一个新的阅读框唯一的存在于大肠杆菌O157:H7基因组中。我们选用大肠杆菌O157:H7参考菌株EDL933、非大肠杆菌O157菌株和类似肠道菌株沙门氏菌、志贺氏菌等，建立PCR进行检测和区分这些病原菌，结果表明该新的阅读框是大肠杆菌O157:H7特异而稳定的标签性基因。这些研究结果促使我们进一步研制用于检测大肠杆菌O157:H7的新型PCR试剂盒。

三、发现内容

技术问题本发明目的在于提供一种特异性检测大肠杆菌O157:H7引物序列和试剂盒。

技术方案本发明的具体实施方案如下：

1、引物设计：BLAST比对大肠杆菌O157:H7基因组序列，找到其特有基因，运用DNAStar软件设计引物对，由序列SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2组成。扩增产物为354bp。

 

2、PCR扩增，包括以下步骤：

（1）大肠杆菌O157:H7细菌培养和模板制备：接种环蘸取-70℃保存菌种，划线接种于山梨醇麦康凯平板，37℃培养20h，单个菌落接种5mL 心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中；如待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装）培养20h，次日，取细菌培养液1mL，12000r离心10min，100μL 纯净水重悬菌泥，煮沸10min，12000r离心10min，上清即为待检模板；

（2）PCR扩增：在0.2mL的PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5uL、2.5mM的dNTPs 2.0uL、25mM的MgCl2 1.5 uL、20pmol/uL碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物pZF和pZR各0.2 uL、DNA聚合酶1、DNA模板2uL，补加超纯水15.6 uL至总体积25uL。95℃预变性5min，94℃ 30s，50℃-60℃梯度退火 30s，72℃ 40s，29个循环，72℃再延伸5min，扩增PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，只有目的条带的最高退火温度，即最佳退火温度为60℃。

（3）敏感性试验：首先选用大肠杆菌O157:H7细菌纯培养物，而后选用模拟制备的大肠杆菌O157:H7污染样品分析PCR的敏感性。

（4）特异性试验：选用极易与大肠杆菌O157:H7混淆的细菌进行特异性检测。

（5）试剂盒组装：PCR预混液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和纯净水。

有益效果