[发明专利]LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及丝状真菌非靶向代谢组学研究中的一种样品制备及检测方法，具体为：基于LC-MS分析平台，建立一种适用于稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌丝组织代谢组学样品制备检测方法。

背景技术

自20世纪90年代提出代谢组学（Metabonomics）的概念以来，代谢组学发展迅速，随着检测手段及数据分析技术的不断更新，代谢组学已经深入到基础生物学研究的方方面面，并在揭示生命基本活动及规律方面发挥着越来越重要的作用（Nicholson and Lindon，2008）。

目前，代谢组学研究一般包括：样品制备、代谢分析平台数据采集、多变量数据分析、目标物识别和研究结果的解释与应用等步骤。

在代谢组学研究中，样品制备是最容易引入系统误差的一步，样品制备分为组织取样、匀浆、提取、保存和样品预处理等步骤（Fukusaki and kobayashi，2005）。代谢物作为生物体中的终产物，在很多时候其差异比生物体相应的转录和蛋白质水平显示的差异要大，是代谢组学分析较之其他“组学”的优势之一。同时也正是因为生物代谢途径对外界环境扰动的敏感，造成不同生物个体之间的代谢物组成及含量差异很大。已有研究表明，即便是在严格控制的生长条件下，分析样品之间代谢组的生物差异也要高于其他系统差异好几倍（Roessner et al.，2000）。所以在样品取材、提取方法及分析方法尽量保持一致，以尽量避免引入系统误差。代谢产物通常用水和有机溶剂（如甲醇和乙腈等）分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开。然而生物代谢物千差万别，其中很多物质稍受干扰，结构就会发生改变，且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有通用所有代谢物的提取方法，只能根据所要分析的特定生物物种组织材料、目标代谢物特性及使用鉴定手段选择合适的提取方法，而提取时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等则是影响样品制备的水平的重要因素。

丝状真菌尤其是植物病原菌（如稻瘟病菌等）代谢组学的研究国内外报道较少，对于其代谢组学样品的提取方法没有统一适用的标准，因此建立一种高效、快速、重现性好的代谢组学样品提取及检测方法开展该菌代谢组学的研究，对于寻找稻瘟病菌生长发育、致病过程中的关键代谢物以及潜在药物靶标的发掘具有重要意义，同时，开展稻瘟病菌野生型菌株与不同基因突变体比较代谢组学的研究，将进一步明确突变基因在代谢物积累、变化方面的影响，从而将基因的功能研究推向新的层次，最终有助于更全面理解该水稻病害的致病机理。

现有的关于菌丝组织的样品制备为：

于2012年的发表的丝状真菌代谢组研究的操作Protocol文章，样品制备的工艺操作步骤如下：1）、将三角瓶培养的菌丝物，用移液器吸取10mL，转移至含有20mL萃取溶剂的50mL的大离心管中；2）、取一50mL的注射器，抽出活塞，然后将一100cm²大小的纱布折叠成三层，把它放在注射器的活塞入口；3）、将1步骤中的打离心管中的菌丝物，倾倒在三层纱布上，插入并推动活塞将培养基及水分挤出；4）、然后小心取出活塞，同时避免将菌丝组织带出，向注射器筒内加入10mL水洗溶液，然后再将活塞插入并推动将水分挤出；5）、去除活塞，用镊子将附有菌丝的纱布从注射器底部夹出；6）、然后用刮刀，将纱布的粘着的菌丝一点一点的刮下来；7、随后用液氮速冻，后对菌丝冻干。

上述方法虽然也能收集到菌丝，但操作步骤比较繁琐，费时费力，人为因素干扰较大，可操作性差，样品误差及损失大，且对菌丝样品的完整性破坏性较大，主要缺陷主要表现在以下几点：

1、整个操作过程中步骤繁多，尤其是不断抽拔活塞，每一次都需小心翼翼，避免将菌丝带出，所用的器具物品变换多，容易造成外源物的带入，影响实验的准确性；

2、收集菌丝量少，每次仅收集10mL的菌丝培养物，收集效率低；

3、在用注射器活塞挤压菌丝除水时，不可避免的将菌丝压破，造成内部代谢物的外渗，同时，活塞与菌丝的接触面，会多多少少的沾有菌丝碎片，造成样品的损失，因此，这样代谢物外渗和人为损失造成的误差非常大；

4、同样的问题发生在用刮刀刮取纱布上粘着的菌丝过程中，菌丝因会部分进入纱布的网孔中，且真菌菌丝因分泌多糖等物质，非常粘，用刮刀片很难将其从纱布上刮除干净，而且同样不可避免的刮破菌丝，造成内容物的外渗损失，因此，可操作性难度大，且样品损失及误差大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法。