[发明专利]LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备及检测方法

权利要求书

1.基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，其特征是：包括稻瘟病菌菌丝样品的培养、过滤收集、液氮灭活处理、冷冻干燥；

所述稻瘟病菌菌丝样品的培养为：将稻瘟病菌的菌丝组织于CM液体培养基中黑暗摇菌培养3～4d，培养温度为25.5～26.5℃，转速为100～200rpm；得菌丝培养物；

所述过滤收集为：将菌丝培养物通过抽滤装置收集到干净的滤纸上并抽沥干；

所述液氮灭活处理为：将附有菌丝的滤纸取出折成小纸包，投入到液氮中速冻3～5min；

所述冷冻干燥为：将经灭活处理后的菌丝小包于-35～-45℃的低温下真空冷冻2～3天；从而确保菌丝组织的含水率≤3%；冻干后的菌丝块于-70℃冷藏作为样品备用。

2.根据权利要求1所述的基于LC-MS研究稻瘟病菌代谢组学的样品制备法，其特征是：所述过滤收集为：

先将滤纸铺在布氏漏斗中，用无菌水冲洗一次，然后将菌丝培养物倒入布氏漏斗中的滤纸上，开启真空泵抽滤掉多余培养基，用无菌水冲洗三次并抽沥干。

3.利用如权利要求2所述制备法所得样品进行的检测法，其特征是：将样品依次进行以下步骤：

1）、研磨破碎：

取冻干后的菌丝块进行研磨破碎处理，得菌丝粉末；

2）、溶剂提取：

在19.9～20.1mg的菌丝粉末中加入1.425～1.575mL的提取溶剂，还加入20μL作为内标的浓度为5mg/mL的伞形酮（Umbelliferone）溶液；采用超声提取的方式于24.5～25.5℃提取38～42min；

所述提取溶剂为：在100体积份的体积浓度为75%甲醇中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；

3）、提取完毕后，离心，所得上清过0.22μm的有机相微孔滤膜后进行下述步骤4）；

4）、上机检测：

选用C18色谱柱（2.1×100mm，1.8μm）；进样量2μL；柱温60℃；流动相组成为含0.1%FA的水和含0.1%FA的乙腈，流速0.4mL/min；质谱采用ESI（+）电离方式，质量扫描范围100～1100；

所述含0.1%FA的水为：在100体积份的水中加入0.1体积份的甲酸混合后而得；

所述含0.1%FA的乙腈为：在100体积份的乙腈中加入0.1体积份的甲酸混合后而得。

4.根据权利要求3所述的检测法，其特征是：

所述步骤4）的上机检测中：

色谱梯度洗脱程序参数中，流动相中乙腈的百分比为2min，10%；5min，40%；10min，50%；16min，68%；23min，85%；25min，90%；27min，100%；31min，100%；32min，5%。

5.利用如权利要求4所述制备法所得样品进行的检测法，其特征是：

所述步骤1）为：取冻干后的菌丝块，放入到液氮预冷过的研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末；得菌丝粉末。