[发明专利]一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。 

背景技术

在泌尿系统中，膀胱移行细胞癌作为一种最常见的恶性肿瘤，发病率越来越高。膀胱癌的发生是内在的遗传因素和外在的环境因子相互作用的结果，包括一系列非常复杂的病理变化。肿瘤切除后膀胱癌细胞转移是造成病人死亡的最主要原因。在膀胱癌中，RhoGDI2对肿瘤转移表现出抑制作用，被确定为肿瘤转移抑制因子。临床数据也显示RhoGDI2的低表达与病人肿瘤发生转移和预后状况变差有一定的相关性。目前，RhoGDI2具体的作用途径还不清楚，但已发现内皮素1(ET-1)和神经介素U(NmU)是RhoGDI2下游的两个作用靶点。它们都是G蛋白耦联受体的激活剂。内皮素1是由21个氨基酸组成的，参与血管收缩、组织分化和修复等活动。在肿瘤转移过程中，形成利于转移的循环模式，这种循环模式也存在于肺和肾等内皮素反应组织中。内皮素(ET-1)可以与膀胱癌发生转移的主要部位(骨和肺)直接作用。间接地激活缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子(VEGF)。内皮素1(ET-1)和血管内皮生长因子(VEGF)能够刺激血管平滑肌细胞和内皮细胞的增生，从而促进肿瘤的生长。RhoGDI2通过抑制这两种蛋白来影响相应的信号通路。神经介质U(NmU)的生物学作用与肿瘤微环境有关，可以影响肿瘤的生长和转移。RhoGDI2有可能从细胞质转位到细胞核，与其他的信号分子发生作用，间接地调节NmU在基因转录水平上的表达。此外，研究发现多功能蛋白聚糖(versican)在许多有侵袭转移特征的癌组织中都有表达，它有利于肿瘤细胞的增殖、粘附和迁徙并且可以调节肿瘤细胞在微环境中与基质的相互作用。通过改变肿瘤微环境中的炎症来抑制肿瘤的转移可能是RhoGDI2的一种作用机制。 

RhoGDI2已经被确定为膀胱癌细胞的转移因子，能够有效地抑制细胞的迁移 和侵袭。RhoGDI2重组蛋白有发展为抗肿瘤的药物的潜力。迄今为止，RhoGDI2的研究还集中在探究其作用机制这部分，关于运用基因工程技术大量制备RhoGDI2蛋白，并将其用于抑制肿瘤细胞转移的研究尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高浓度、高纯度的TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 

一种TAT-RhoGDI2融合蛋白，为TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。 

编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。 

一种TAT-RhoGDI2融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤： 

(1)构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒； 

(2)利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白； 

(3)分离纯化TAT-RhoGDI2融合蛋白。 

步骤(1)所述的构建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤： 

a.以序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，PCR反应，获得TAT-RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因； 

b.胶回收上述PCR产物，将目的基因和pGEX-4T-2表达质粒用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆送样测序。 

所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。 

步骤(2)所述的利用大肠杆菌DH5α异源表达GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：