[发明专利]一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种检测结合分枝杆菌复合群的引物对及其应用。

背景技术

结核病是目前严重威胁人民身体健康的慢性传染病之一。世界卫生组织（WHO）曾将结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手。由于抗结核药物的滥用以及艾滋病毒（HIV）等感染而使结核病的疫情再次回升。据WHO估算，全球大约有1/3人口已感染结核病，每年新发生肺结核患者约130万人，每年约有13万人死于结核病，每年近10万个多药耐药结核（MDR-TB）病例。但结核病只要早期诊断并合理用药，绝大多数的结核病是可以治愈的。我国作为人口大国，人口流动性较大，不易对结核病患者进行管理，容易造成肺结核病在人群中的传播。结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)等，其中结核分枝杆菌是引起结核病的主要病因。早期快速、有效的诊断和治疗是结核病控制的关键。

目前临床检测结核分枝杆菌的主要方法是细菌学检测，包括痰涂片抗酸染色检查和细菌培养。痰涂片抗酸染色检查法是全世界最普遍使用的检测方法，它简便、快速、价廉，当天即可出结果，但敏感性低，阳性率在25%-35%。细菌培养法一直以来都是诊断结核的“金标准”，灵敏度略高于痰涂片抗酸染色法，但其培养周期长，一般4-8周才能获得结果。实验室研究的气相色谱法需要高精密度分析仪，分析过程的条件选择和质量控制都需严格要求。从1985年Mullis创建了聚合酶链式反应（PCR）技术，到1989年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，再到1990年我国引进该项技术，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。由于PCR具有快速、灵敏、特异的优点，非常适合结核分枝杆菌这类生长缓慢细菌的快速诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测结合分枝杆菌复合群的引物对及其应用。

本发明所提供的用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

进一步，组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比可为1：1。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒具体可含有所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。

制备所述引物对和所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

进一步，制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。

制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质包装于同一个试剂盒内：dNTP和DNA聚合酶。

所述引物对，或所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：（1）在检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的应用；（2）在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种利用所述引物对，或所述试剂盒检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的方法。

本发明所提供的利用所述引物对，或所述试剂盒检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的方法，具体可包括如下步骤：

（1）从待测样本中提取DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

（2）根据步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群：若PCR产物中含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有结核分枝杆菌复合群；若PCR产物中不含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有结核分枝杆菌复合群。

在所述方法的步骤（1）中，进行所述PCR扩增的反应条件具体为94℃5min；30个循环：94℃30sec、56℃30sec、72℃45sec；最终延伸72℃7min。

在所述方法的步骤（1）中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每条单链DNA分子的终浓度均为0.5μM。

进一步，进行所述PCR扩增的反应体系具体为2×Premix Taq10μl，10μM的上下游引物各1μl（终浓度均为0.5μM），DNA模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。