[发明专利]一种磁性二氧化硅复合微球的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学试验领域，涉及一种磁性二氧化硅复合微球及其制备方法和应用

背景技术

20世纪90年代以来，随着纳米科技的发展，磁性材料已步入磁性纳米材料的新纪元。磁性纳米材料与体相磁性材料相比磁学性质发生了很大变化，具有非常广阔的应用前景，已经成为国际上的研究热点。磁性粒子在蛋白分离、药物靶向等方面的应用，也是当前生物领域中的热门研究课题之一。在众多的磁性纳米材料中，超顺磁性Fe3O4纳米粒子在生物体中易代谢分解，因此Fe3O4纳米粒子在生物医药方面具有潜在应用。一种合成单分散Fe3O4纳米粒子的常用方法是含铁的配体化合物（如乙酰丙酮化合物、乙酸盐、油酸盐等）的高温热分解，此反应是在非极性溶剂中发生的，获得颗粒接近单分散，但是疏水性的且不适合生物应用。为解决这个问题需要将疏水的Fe3O4纳米粒子进行表面修饰，使其变成亲水性的。SiO2包覆方法是一种很好的改性方法，因为SiO2具有很好的生物相容性和稳定性，无毒且容易进一步和不同官能团结合。对于二氧化硅表面的硅羟基进行氨基化修饰，再接入交联臂戊二醛。此磁性二氧化硅复合微球的交联臂含有醛基，通过亲核加成反应与配基蛋白结合，戊二醛与蛋白反 应具有活性高、反应快、结合量高、交联性好且交联产物性质稳定，并可保持蛋白质的精细结构，对酶的活性影响小，固定的蛋白质染色性能好等特点。再通过配基蛋白与目标蛋白之间的特异性结合，进行目标蛋白的分离。相较于其他分离手段，磁分离纯化蛋白质技术具有如下优势：操作缓和，能确保蛋白质结果的完整性，可以从蛋白质含量较低的样品中迅速富集浓缩，获得较高浓度的提纯样品，纯化步骤简单，甚至可以集细胞裂解与蛋白质分离于一步完成。磁性二氧化硅复合微球具有抗酸碱腐蚀、抗压、无毒、稳定性好，可重复利用等优点。

对现有技术的文献进行检索发现，研究磁性分离蛋白的文献专利很多。中国专利200410057258.1申请了一种生物多糖高分子磁性微球及其制备方法，中国专利200510116850.9申请了一种复合生物多糖磁性微球制备方法，上述方法制备的微球抗压和抗腐蚀性能都较差；中国专利200610147250.3申请了表面固定有蛋白酶的带氨基的纳米磁性微球及其制备方法和应用，中国专利200710047399.9申请了带有表面官能团的磁性微球的制备方法，上述方法直接在磁性微球表面氨基化后应用，磁芯四氧化三铁极易被腐蚀。本发明克服了这些缺点，而且粒径小，相同质量微球比表面积大大增加，增加分离效率，而且磁芯不易被腐蚀，可回收利用，利于工业化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，制备出磁性微球粒径小，单分散性好，带有氨基的复合微球比表面积大的磁性二氧化硅复 合微球。利用亲核加成反应，接入交联臂戊二醛后，可以接入多种配基蛋白，从而可以分离多种目标蛋白。

本发明的技术方案如下：

一种磁性二氧化硅复合微球，包括超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，其特征在于：超顺磁性四氧化三铁纳米粒子直径为4-30nm，超顺磁性四氧化三铁纳米粒子外表面包覆有壳厚5-20nm的二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳表面进行氨基化修饰，用戊二醛作为交联臂，再接入配基蛋白。

一种磁性二氧化硅复合微球的制备方法，该方法包含下面的步骤：

（1）四氧化三铁前驱体的制备；

（2）利用反相微乳液法制备二氧化硅包覆的四氧化三铁磁性微球；

（3）磁性微球表面降低非特异性吸附的处理；

（4）接入配基蛋白。

所述步骤（1）具体分为两步：

第一步，将氯化铁和油酸钠以摩尔比为1：1～1：5溶于水、乙醇和正己烷混合溶液中，其中水、乙醇和正己烷体积比为3～4：4：7，在常温氮气环境下磁力搅拌，并加热至50～80℃，冷凝回流3～6h；待溶液冷却至室温，利用分液漏斗分离上层有机相，并用去离子水洗涤干燥，得到棕褐色蜡状固体，即得到油酸铁前驱体；

第二步，将第一步制备的油酸铁前驱体溶于十八烯中，加入油酸， 其中油酸与十八烯的摩尔比为1：1～5：1，以加热速率2～10℃/min加热至300～380℃，冷凝回流一定时间30～60min至溶液中发生强烈反应，待溶液变浑浊，呈黑褐色，关闭反应器，直至溶液冷却至室温，加入过量乙醇沉淀Fe3O4纳米粒子，离心分离；

沉淀—再分散操作：将上清液倒出，将纳米粒子溶于正己烷中，再加入过量乙醇沉淀出Fe3O4纳米粒子，离心分离；

重复上述沉淀—再分散操作，洗涤4～5次，得到疏水Fe3O4纳米粒子。