[发明专利]重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学技术领域，具体涉及一株表达猪圆环病毒2型ORF2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒及其制备方法。 

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今为止发现的最小动物病毒之一。可根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两个基因型。PCV1广泛存在于猪体内及猪源细胞系中，无致病性，不能引起细胞病变；PCV2具有致病性，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。猪由PCV2感染而引起的各种疾病已遍布世界各地，给世界养猪业带来巨大损失。猪圆环病毒2型有两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，其中ORF2基因是PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，可自我装配成病毒样粒子，并且ORF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，已成为目前PCV2疫苗研究的主要候选基因。PCV2疫苗的研究，目前已有PCV2灭活疫苗、PCV2DNA疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗，但有关病毒活载体疫苗的报道相对较少。 

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。其危害主要表现为母猪流产，产死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡等综合征，临床以产死胎为主。该病毒基因组庞大，其容量可高达40kb，具有足够的空间允许外源基因的稳定插入，并且重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病毒和其它相应传染病的抵抗力，具有一个优良活病毒载体的基本特征。其中最引人注目的是表达猪瘟病毒主要保护性抗原E2基因的重组伪狂犬病毒，目前此疫苗株的遗传稳定性，外源基因对病毒增殖的影响以及生物安全性均已得到论证，有望投入生产使用。 

白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是从被热灭活痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)感染和脂多糖(LPS)诱发的中毒性休克小鼠肝脏提取液中获得的一种由应激诱生的蛋白，其诱生IFN-γ的能力很强，因而最初被称为IFN-γ诱生因子(Interferon gamma inducing factor，IGIF)。1996年成功从鼠cDNA库中筛选到人的IGIF基因，并在大肠杆菌中表达，因其序列与所有已知的细胞因子不同，且生物活性多样，故将其正式命名为白细胞介素18。IL-18能诱导IFN-γ大量分泌表达，促进T细胞增殖及Th1细胞的免疫应答，增强NK细胞的杀伤活性，抑制Th2类细胞因子的生成，具有广泛的生物学效应，在免疫调节、 抗肿瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。 

绿色荧光蛋白(GFP)存在于发光水母体内，是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质。同以往常用的报告基因LacZ、CAT、荧光素酶基因以及其它抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、无污染、稳定，当受到紫外光或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。因此其被广泛应用于分子生物学研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：表达PCV2 ORF2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒PRV-PCV2-IL18 PGO18 

，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年11月18日，保藏编号CCTCC NO：V201345。

本发明的技术方案是：一种重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO：V201345。 

所示的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，以pGEMT-IL-18为模板，扩增猪IL-18基因，利用重组技术插入到含有PCV2ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒转移质粒PGO中，构建载体PGO18，将猪伪狂犬病毒弱毒株感染ST细胞后，再转染重组质粒PGO18，经蚀斑纯化得到重组猪伪狂犬病毒。 

所述构建载体PGO18的步骤如下： 

①根据重组质粒pGEMT-IL-18中猪IL-18基因片段设计1对引物，所述引物序列为： 

上游引物序列：5’-TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’，