[发明专利]重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法

权利要求书

1.一种重组猪伪狂犬病毒毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC NO：V201345。

2.如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：以pGEMT-IL-18为模板，扩增猪IL-18基因，利用重组技术插入到含有PCV2 ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒转移质粒PGO中，构建载体PGO18，将猪伪狂犬病毒弱毒株感染ST细胞后，再转染重组质粒PGO18，经蚀斑纯化得到重组猪伪狂犬病毒。

3.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述构建载体PGO18的步骤如下：

① 根据重组质粒pGEMT-IL-18中猪IL-18基因片段设计1对引物，所述引物序列为：

上游引物序列：5’- TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’，

下游引物序列：5’- CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG -3’；

② 猪IL-18的PCR扩增

以pGEMT-IL-18为模板进行PCR扩增，体系如下：

                                                                   

反应条件：94℃ 5min；95℃ 1min；55℃1min；72℃ 1min共进行30个循环，72℃延伸10min；

扩增产物用0.8%琼脂糖进行电泳检测；

③ 将回收纯化的猪IL-18产物用BglⅡ酶切，体系如下：

       

             

混合物瞬时离心后置37℃水浴酶切8h，产物用0.8%琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒对产物进行回收；

④ PGO质粒用BglⅡ进行酶切并用碱性磷酸酶（CIAP）对酶切产物进行去磷酸化处理，体系如下：

         

上述混合物振荡均匀，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收；

⑤ 载体PGO与外源片段猪IL-18的连接

将步骤④得到的回收产物与经过BglⅡ酶切处理的猪IL-18进行连接，在16℃连接槽中连接12~16h，得到的连接产物转化入DH5α感受态细胞，转化后提取重组质粒，得到阳性质粒为PGO18。

4.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述转染重组质粒PGO18的步骤如下：用BIOMIGA无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒PGO18至1μg/μL备用，复苏细胞，转染前24h将ST细胞传至第3代，将细胞悬液加到6孔板中，先用PRV疫苗株接种至90％的ST细胞，吸附1.5h后，将质粒PGO18进行转染，置37℃、5％CO₂下培养5h后，吸弃孔内培养液，每孔加入1.5mL细胞维持液，于37℃、5％CO₂下继续培养36h，收获病变细胞，反复冻融3次用于重组病毒的筛选。

5.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述蚀斑纯化的步骤如下：将转染获得的病毒液按10^﹣1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6进行稀释，各取400μL接种到ST细胞长至单层的6孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h后，每孔加入2mL低熔点营养琼脂糖，培养48h，此时在荧光显微镜的蓝光(波长420~490nm)下能观察到绿色和无特殊荧光颜色的两种病毒蚀斑，在荧光显微镜下用巴氏吸管吸取绿色蚀斑，加入DMEM维持液于-20°C反复冻融3次，然后将收获的病毒液接种到含单层ST细胞的24孔细胞培养板内至90％以上的细胞发生病变时收毒，将每孔收集的病毒提取DNA并进行PCR扩增，选择PCR阳性的病毒进行下一轮的蚀斑纯化，直至获得纯净的重组病毒PGO18。