[发明专利]一种用于Gateway克隆系统的表达载体

说明书

技术领域

本发明公开了一种用于Gateway克隆系统的表达载体，属于生物技术领域。 

背景技术

Gateway技术是由Invitrogen公司开发的进行基因克隆的一项新技术，是一种快速、高效的大规模克隆系统，与传统方法相比，对载体和宿主没有依赖性。 

Gateway技术原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的作用下，lambda噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。Gateway技术可以方便快捷地克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统，克服了传统载体构建过程中需进行的多次酶切和连接反应的繁琐操作步骤及酶切位点的限制等缺点，同时典型的克隆效率高达90％或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。 

Gateway技术主要包括2个反应(参考附图1)：BP反应和LR反应。BP反应是创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将两端携带attB位点的目的基因克隆进入门载体。LR反应是将包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体进行重组，构建表达克隆。入门载体目的基因两端具有attL1和attL2重组位点，目的载体上具有attR1和attR2重组位点，在LR Clonase II的作用下，两个载体间发生定向重组，从而将目的基因连接到目的载体上。另外，Gateway重组技术利用了ccdB致死基因。ccdB蛋白干扰大肠杆菌DNA促旋酶，抑制大肠杆菌大部分菌株的生长(例如DH5α和TOP10菌株)。由于ccdB蛋白的致死作用，只有携带重组成功的目的载体的克隆才能生长，而入门载体或未重组的目的载体克隆由于带有ccdB致死基因而不能生长，极大地降低了高背景的缺点，减少筛选时间。同时，结合抗生素筛选，转化产物重组率可高达90％以上。目前该技术已广泛用于基因的克隆和表达载体的构建。 

与Gateway技术兼容载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究，但应用这些载体系统的一个瓶颈问题是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种用于Gateway克隆系统的表达载体，其构建方法将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合，构建了与Gateway技术兼容的目的克隆表达载体，用于克隆的目的基因或其他来源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表达。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

一种用于Gateway克隆系统的表达载体的构建方法，构建方法包括下述步骤： 

1)使用限制性内切酶Not I分别酶切pART7载体质粒DNA和pART27双元载体质粒DNA，将pART7载体质粒DNA酶切片段插入到pART27双元载体质粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa载体质粒DNA；将该pART27-35Sa载体质粒DNA通过限制性内切酶Sma I进行酶切，插入Gateway阅读框B片段，得到表达载体pART27-35Sa-GWB； 

其中，pART7载体质粒DNA酶切片段按照花椰菜花叶病毒35S启动子和章鱼碱合成酶基因3非编码区与报告基因NPTII方向相同的顺序插入到pART27双元载体质粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa载体。 

2)使用引物从表达载体pART7-DHA中扩增出90bp的双HA标签序列片段：5-AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3； 

通过引入上述标签序列可有效用于蛋白表达分析。 

上述所得的双HA标签序列片段，对应的氨基酸序列为KLGGTGGSYPYDVPHYAGYPYDVPDYA-SR，其中HA抗原(YPYDVPDYA)的串联重复前放置有随机线圈序列(GGTGGS)。 

其中，所用的特定引物序列如下： 

PR1： 

5-ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA-3； 

PR2：