[发明专利]HCV重组融合抗原及其表达基因和制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体是涉及一种HCV重组融合抗原及其表达基因和制备方法

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis c virus，HCV)感染引起的，非A，非B（NANB）病毒性肝炎。1974年laneld首次报告输血后非甲非乙型(NANB)肝炎，1989年Choo等成功从受感染的黑猩猩血液标本中分离得到(NANB)病毒，并从此展开对这一陌生病毒的研究。据世界卫生组织统计，全球HCV的平均感染率为3%左右，约有117～210亿人感染HCV，每年新发病例约315万例，每年约有35万人因丙肝相关疾病而死亡。

丙型肝炎病毒主要通过血液传播，占据输血后肝炎的80-90%，急性丙型肝炎中，50%-60%患者会发展成慢性肝炎，其中20%又有可能进一步发展成肝硬化。由于目前没有有效治疗丙型肝炎的药物，早期发现HCV感染，准确判断病毒亚型及患者感染状况，是有效防控丙肝的重要手段。因此，研制特异性强、灵敏度高和稳定性好的诊断试剂，对血源及血制品执行严格筛查程序，是控制HCV传播的必然选择。

HCV是黄病毒科，正链RNA，全长9.5kb，仅有一个开放阅读框,编码一个3011个氨基酸的聚蛋白前体。蛋白前体在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下,被切割成多个功能蛋白,包括结构蛋白:核衣壳蛋白Core，囊膜糖蛋白E1和E2，和非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。该病毒的这一复杂的蛋白组成体系给丙型肝炎病毒诊断试剂的研发带来很大困难。从1989年HCV的发现至今，国际HCV诊断试剂的发展先后经历三个阶段。第一代抗-HCV ELISA诊断试剂采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶(SOD)基因嵌合后表达的融合蛋白，由于C100只含363个氨基酸，而HCV基因组编码的蛋白有长达3011个氨基酸，因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原-抗体系统中很小部分，所以敏感性不高，很难满足试剂检测需求；另外，抗C100-3出现比较晚，不满足早期诊断的基本条件。第二代抗-HCV ELISA诊断试剂在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c，使检出率提高了25%～30%，而且检测抗体的窗口期也有所缩短，但由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题和少数漏检问题。当前用的第三代抗-HCV ELISA诊断试剂，其包被抗原为HCV核心抗原Core，NS3、NS4和NS5抗原，使特异性达到99%。虽然第三代HCV抗体ELISA诊断试剂增加了HCV NS5区表达的蛋白作为抗原，提高了试剂敏感性，但从HCV感染到可检测出抗体仍40多天，因此，第三代ELISA诊断试剂的质量仍有很大改进空间。

目前，国际上的主流试剂主要是采用HCV基因组表达的多区段优势抗原，如结构区核壳蛋白C22、非结构NS3区C33c、NS4区C100或5-1-l抗原等组装成HCV诊断试剂，如HCV3.0SIA。HCV3.0SIA是目前公认的丙型肝炎确诊试剂，经调查，该试剂也是国内外很多科研院校相关学术研究成果报道中的确诊参比试剂。该试剂也是选用了HCV的主要的优势抗原表位，包括两个重组抗原（C33C和NS5）及两个合成多肽（C100P和5-1-1P）。但是单个小蛋白的表达耗时费力，合成肽成本高，在胶体金检测试剂中的应用更加困难。