[发明专利]骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品

说明书

技术领域

本发明描述了骨骼肌全器官脱细胞基质（(Whole organ acellular matrix,WOACM))及其衍生出的医疗产品如微粒、流体化组合物、凝胶和活性肽等的制备方法及其用途。涉及领域包括组织工程与再生医学、外科学、生物材料学。 

背景技术

骨骼肌缺损的治疗，特别是大范围肌肉缺损的功能重建，到目前为止仍是临床难题。骨骼肌占人体重量的40-50％。骨骼肌系统创伤也是人体最常见的创伤之一，据统计30-55％的运动损伤、50-70%的战伤均涉及到骨骼肌。轻微骨骼肌损伤，如各种挫伤或拉伤，骨骼肌组织能依靠成肌细胞(卫星细胞)再生肌纤维实现自我修复。然而，缺损量超过20%的骨骼肌创伤难以实现功能性修复而伴有疤痕形成、远心端肌肉失神经支配萎缩、功能障碍。针对这些患者，目前临床的标准治疗是自体取材修复，包括各种肌皮瓣移植，虽能部分恢复损伤区功能，但存在可利用的肌肉来源有限、组织解剖结构和生物力学改变、供区损伤等不足；以“创伤修复创伤”也不符合外科微创化的发展方向。总之，骨骼肌缺损的治疗，特别是大范围肌肉缺损的功能重建，到目前为止仍是临床难题。通过诱导组织再生实现大范围骨骼肌缺损的功能重建符合医学需要，该项技术具有广阔的前景。 

细胞外基质具有迄今最好的体内骨骼肌诱导再生效果，但仍有改进需要。骨骼肌是单一功能器官，理论上来说较肝脏、肺等脏器更容易通过组织工程和再生医学技术实现其功能性再生。事实上，目前组织工程骨骼肌的进展已落后于肝脏和肺等领域，原因是骨骼肌具有复杂的超微结构，包括平行排列的、周期性的三维骨骼肌基底膜管结构，肌肉-肌腱接头等，这些结构都非常难于人工模仿。此外骨骼肌具备功能的前提是受神经支配以及足够的血管网络提供营养和氧分(肌细胞是物质代谢非常旺盛、高耗氧细胞)，而目前各种体外构建环境，包括生物反应器在内，均难以提供骨骼肌细胞生长发育所需的氧分和营养支持。此外有研究发现，酶消化获得的骨骼肌成肌细胞(Myoblast)在分离和扩增过程中会丧失再生骨骼肌纤维的能力。直接将肌源性干细胞接种到受损部位至今未有接种的干细胞存活率达到1%的报道。上述困难驱使人们研究可否在体内诱导骨骼肌组织再生，如仅提供生物化学信号调节局部微环境加速骨骼肌再生、减少疤痕形成。这方面国外学者已取得令人瞩目的突破，即应用脱细胞基质(Acellular matrix,ACM)支架材料，如猪小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa,SIS)基质、膀胱基质(Urinary bladder matrix,UBM)，在体内实现骨骼肌功能性再生。这些ACM的成 分为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)，主要由I型和Ⅲ型胶原纤维组成，含少量V型和Ⅵ型胶原纤维，有一定孔隙率，其余部分主要为糖蛋白、纤维粘蛋白、氨基葡聚糖(硫酸软骨素、透明质酸、肝素等)，易于细胞粘附并能促进粘附的细胞生长增殖；含有多种细胞因子，包括成纤维细胞生成因子(FGF)-2、转化生长因子(TGF)-β和血管内皮生长因子(VEGF)等；还有良好的可降解性和降解速率可控性，无抗原作用。ECM修复骨骼肌缺损的机理是“内源性组织再生”:植入后ECM能够实现快速再血管化，其中的生物活性信号蛋白和生长因子吸引干细胞迁移进入支架材料，并诱导干细胞分化形成位置特异性主质细胞如骨骼肌成肌细胞、血管前体细胞；随着持续的ECM材料的降解和持续的宿主细胞新生基质沉积，功能性骨骼肌组织开始形成，恢复成它的起源结构、功能性和生理性状态。实验动物骨骼肌缺损区使用ECM填充修复，虽然未接种干细胞，但也能够再生出功能性骨骼肌。Valentin等使用SIS修复大鼠腹壁缺损，6个月后在修复区看到岛屿状功能性骨骼肌组织，其产生的收缩力可达到正常腹肌的80％。同样，Turner等在犬8×4cm大小部分肌肉缺失模型中，6个月后同样观察到SIS修复区有血供良好、受神经支配、有收缩功能的骨骼肌新生，几乎与修复区周围正常肌肉组织难以区分。当然，预接种干细胞会进一步加快组织再生速度；Conconi等发现大鼠腹肌ECM体外接种成肌细胞后重新植入修复大鼠腹壁缺损，仅9天即可形成具有复杂结构、可收缩、血管化的骨骼肌组织。上述研究结果国外已转化为临床应用，即植入ECM材料促进遭受中等范围骨骼肌损失的患者实现肌肉功能重建，改善肢体残疾。已有的报道均来自于美国军方。第1例临床应用是采用UBM为一名自阿富汗战场返回的右下肢腓肠肌部分被炸飞的士兵实现了肌肉再生，受伤部位的骨骼肌肌力恢复到对侧的70%。我国的报纸《参考消息》也转载了这一成果（第19120期，2011年6月21日）。第2例是一名右大腿根部部分骨骼肌缺失的士兵，他接受多层SIS植入治疗时距他受伤已有3年。在这3年中，他的受伤区是疤痕修复，虽经多年康复治疗，他仍一直有明显的右膝伸直困难。接受SIS植入后4月，他的这一症状明显改善，受伤区肌力提高了30%。不过值得注意的是，这一方法目前仍存在一些局限性，包括①操作繁琐，上述研究中所用的ECM材料是UBM和SIS，虽然来源方便，但因为UBM和SIS的平均厚度不到100μm，要达到缺损骨骼肌的体积需要层叠数百层的材料；②再生骨骼肌并不是真正意义上具有全部收缩功能的骨骼肌：骨骼肌物质代谢非常旺盛，骨骼肌剧烈运动时其内的血流量能达到平静状态时的20-80倍，故正常人体骨骼肌均有较粗直径的支配血管且每平方毫米肌肉中有1350-3000条毛细血管；而UBM和SIS植入区再生骨骼肌的血供均由周围组织侵入的毛细血管提供，无明显支配血管、毛细血管密度也不足，无法提供剧烈收缩时需要的血流量；③UBM和SIS未能反映出天然骨骼肌基质的复杂结构，再生骨骼肌的肌纤维排列不理想。总之ECM诱导骨骼肌功能性再生是一项非常有前景的技术，但目前仍有值得深入研究改进措施的地方。