[发明专利]耐药基因TetK LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测耐药基因TetK的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测耐药基因TetK的方法。 

背景技术

四环素类药物是发现于上个世纪40年代的一类广谱抗生素，从50年代开始应用于医学临床。由于其具有抗菌谱广和毒性低等特点，四环素类抗生素成为养殖业防治多种革兰阳性及阴性细菌感染，单细胞细菌及原虫感染，以及各种非传染性动物传染病的常见药物。 

近年来，随着四环素类药物在动物养殖业的广泛应用，四环素耐药株也迅速产生，耐药率持续增加，对疾病的治疗构成了严重的威胁。迄今为止，已发现了40多种不同类型的四环素耐药基因，主要介导3种不同的耐药机制，分别为核糖体保护机制(Target protection）、外排泵机制(Active efflux)和酶降解机制(Enzymatic degradation)。其中，外排泵机制对细菌耐药性的产生发挥着重要作用。四环素的外排泵耐药基因通过编码膜相关蛋白使细菌细胞内四环素主动泵出胞外，从而起到降低细胞内药物浓度及保护细菌的作用，同时使细菌产生耐药性。TetK是编码外排泵蛋白的耐药基因之一（基因登录号：gb|S67449.1），是介导四环素耐药性的重要基因。 

为了更好的防治临床细菌感染，并及时采取措施将其造成的经济损失控制在最小的范围，我们必须根据细菌感染的特点采取快速检测方案。 

传统的微生物培养法和药敏试验法由于其检测时间过长，通常会影响治疗效果，给养殖业造成极大的经济损失。随着分子生物学技术的快速发展，用分子工具诊断病原菌已经得到了广泛的应用，现今针对耐药基因快速检测技术多为多重PCR。这项技术虽然能够有效检测出细菌的耐药基因，但由于其往往需要昂贵的配套设备或者较长的检测时间而难以在广大基层范围内进行推广。与多重PCR相比，环介导等温扩增(LAMP)对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确诊断细菌耐药性探索一种新方法。 

发明内容

本发明的目的就在于克服其他检测方法的缺陷，研制一种耐药基因TetK LAMP检测试剂盒及其检测方法。 

本发明的技术方案是：一种耐药基因TetK LAMP检测试剂盒，包括以下成分： 

（1）反应液A： 

含有10×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶8U/μL、l0mM dNTP、10μM内引物1、10μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和4M甜菜碱，其中： 

10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH8.8）、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%（m/V）曲拉通X-100（pH8.8，25℃）； 

内引物1为:ACAACCACCATAATCAGTGAAGGG-TTGATTTTTGGTAGGTTAGTACA（SEQ ID.1） 

内引物2为:AACAAGGCAAAGCCTTTGGT-CCCCTATTGAAGGACCTAAC（SEQ ID.2） 

外引物1为:ATTGCTTTTATTGGTCACAATC（SEQ ID.3） 

外引物2为:AGACCAATGAATATAATGTGCTA（SEQ ID.4） 

（2）反应液B：50mM MgCl₂

（3）反应液C：100×的荧光染料SYBR Green I。 

反应液A每管24μl的组成为：5μL10×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶(8U/μ1)、3.5μL l0mM dNTP、2.5μL10μM内引物1、2.5μL10μM内引物2、0.4μL l0μM外引物1、0.4μLl0μM外引物2、5.0μL4M甜菜碱。 

本发明的另一技术方案是: 

一种耐药基因TetKLAMP检测试剂盒检测耐药基因TetK的方法，其主要技术步骤包括： 

(1)耐药基因TetK的环介导等温扩增 

在装有24μL反应液A的反应管中加入1μL待检样品处理液，于60-65℃恒温水浴箱中放置70min； 

(2)扩增产物的显色检测 

在上述反应管中依次加入1μL反应液B和1μL反应液C，室温放置10min，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有耐药基因TetK；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有耐药基因TetK。