[发明专利]高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法

说明书

本申请是2008年3月28日提交的题为“高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法”的国家申请号为200880018252.X(PCT／US2008／058786)的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请按照35U.S.C.§119(e)要求申请日为2007年3月28日的美国临时申请60／908,604的优先权，其以参考方式全文纳入本文。

技术领域

本发明大体上涉及用于制备和分析生物样品的系统和方法，以检测与目的表型相关的核酸序列变异。在某些实施方式中，提供了用于扩增来自生物样品的微生物的核酸以及检测与药物抗性和／或敏感性相关的序列变异的方法和系统。

背景技术

在科学史上很少有像控制病原微生物所取得的进展这样对人类生活产生如此巨大的影响。直至19世纪末期和20世纪初期Pasteur和Koch的工作才确立微生物作为传染性疾病的诱因并提供了引起理论预防的策略和控制策略。磺胺类药剂是最初被发现抑制微生物感染的一组化合物，虽然对其作用机理知之甚少，但是该发现刺激了大规模寻找更有效的抗生素化合物。1940年Florey和Chain分离出不纯的但是高活性的青霉素制备物，后来青霉素的成功转移科学努力朝向抗生素的探索，这引起约3000种被命名的抗生素的发现。但是，虽然发现新化合物迅速发展，但是只有50种指定的抗生素满足临床用途，甚至更少的被普遍用于治疗微生物疾病。

抗生素对于抵抗微生物感染的最初有效性已经被对各种抗生素呈抗性的微生物菌株的出现所抵销。由于微生物的加速进化适应性、临床上抗生素的加速滥用和病人缺少完成所开剂量方案的服从，所以抗生素抗性被证明是难以克服的。抗性问题使得很多本来能治愈的疾病例如淋病和伤寒症变得难以治疗。此外，微生物对万古霉素(一种最后的广泛有效的抗生素)的抗性在医院正变得越来越多的普遍。

一直在开发新的抗生素化合物以阻挡传染性微生物，对抗生素抗性的机理的理解被证明在开发过程中是有价值的。基因组学的进展使研究人员可以鉴定易于发生抑制或修饰的生化途径，并理论设计靶向这样的途径的药物。很多药物通过与微生物蛋白结合并改变其结构和／或功能而显示出治疗性效应。在这样的情况下，微生物可以以感染药物结合或活性的方式而对靶蛋白进行物理修饰从而发展免疫力。例如，在几种微生物中对抗生素红霉素的抗性来源于50S核糖体亚基的变异，该变异引起核糖体与红霉素亲和力的降低。由于蛋白的结构／功能是由其初级序列决定的，而初级序列又是由编码蛋白的核酸的序列决定的，所以与药物抗性表型相关的核酸序列变异对于药物抗性的诊断指示剂是有用的。

虽然已经建立了鉴定微生物中核酸序列变异的方法，但是现有的方法受到需要预先知道用作诊断指示剂的特定突变或其它变异的要求的限制。结果，已知的筛选程序经常忽视那些与药物抗性或者其它目的特性相关的新发生的和／或未鉴别的序列变异。

因此，本领域需要快速的、承担得起的和可靠的既检测已知的又检测未知的核酸序列变异的方法，所述核酸变异具有诊断应用，包括与众多生物例如酵母、病毒、真菌、细菌、寄生虫甚至人类中的药物敏感性和／或药物抗性模式相关的突变。

发明内容

在一些方面，提供了用于确定微生物对药物的反应性的方法，该方法包括，从病人获得生物样品，样品包含感染性微生物；扩增微生物的一个或多个DNA片段，所述一个或多个片段包括与微生物对目的药物的反应性相关的至少一个多态性；检验一个或多个扩增的DNA片段相对于参考序列的序列变异，其中所述一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征微生物对药物的反应性。

在一些优选的实施方式中，使用高解析度熔解曲线分析来检验扩增的DNA的序列变异。在各种实施方式中，熔解曲线分析包括：在存在DNA结合荧光染料时(该染料在存在双链DNA(dsDNA)时相对于存在单链DNA(ssDNA)时发射出实质上不同水平的荧光)，将互补的参考序列例如野生型序列和扩增的DNA(靶DNA)一起孵育。在一些优选的实施方式中，DNA结合染料是dsDNA特异性染料，例如SYBR Green I或SYBR Green II，熔解曲线分析包括：随着以恒定速率缓慢加热检验溶液，监测荧光水平作为时间的函数。有利地，本文所提供方法的熔解曲线分析能够精确地检测靶DNA序列和参考序列之间的单一碱基对错配，和／或两个、三个、四个、五个或更多个碱基的错配。