[发明专利]可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料，具体涉及蚕丝蛋白的加工利用技术，更具体是可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法。

背景技术

组织器官缺失及机能障碍是影响人类生存质量、导致人类疾病和死亡的最主要原因之一。受损器官修复和重建是生物学和临床医学面临的重大难题。组织工程利用支架材料、种子细胞、生长因子在体外的生物反应器内或生物体内进行组织器官再生。用于组织修复的支架材料是组织工程与再生医学的中心内容之一。在物理特性上，它是种子细胞赖以依附和生存的空间，为组织再生提供空间架构、力学需求和几何形状；在化学特性上，可以协调生物活性因子和细胞之间的相互作用。

按制作特征，组织工程支架可分为：预制固体支架和可注射水凝胶支架两类。体外预制固体支架适用于修复面积大、非包含性缺损。相比之下，可注射水凝胶作为组织工程支架，突出的优势在于：（1）可通过微小侵入技术对分散性、包含性的缺损进行修复；（2）细胞接种较均一，其凝胶网状结构可为细胞提供充分的附着面，使细胞生长在类似生理状态的环境中，这有利于保持细胞活性，并促进细胞分泌大量基质，构建组织；（3）可以保护移植细胞，避免受到机体免疫细胞攻击；（4）可作为生长因子、药物的缓释载体，利于生长因子和药物的定点、持续释放，发挥生物学作用。

甄选基质材料，采取合适的原位交联方法，是目前构筑适用于组织工程支架、缓释药物载体的可注射水凝胶的关键所在。

蚕丝素蛋白是蚕茧脱胶后获得的天然蛋白质，用于临床外科缝线已经数十年。蚕丝蛋白作为组织工程支架材料具有强度高、多孔、易于加工处理、生物相容性好的优点。研究表明，蚕丝素蛋白膜有利于纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、胶质细胞等人类细胞的粘附和生长，无细胞毒性、无致敏性和刺激性，更无致癌性和遗传毒性，适合用作生物材料。

海藻酸盐为D-甘露糖和α-葡萄糖组成的天然多糖，主要来源于海藻产品，广泛用于食品添加剂和创面辅料、药物载体。海藻酸盐溶液可与二价阳离子，如：钙离子（Ca²⁺），形成交联网状结构的凝胶，该过程不受温度影响。该凝胶可载运药物和细胞，控制释放生长因子。但海藻酸盐本身不具有生物信号识别区域，对细胞粘附性不理想，对其进行改性是近年的研究热点。

在生物组织中，细胞外基质以蛋白质和多糖为主要成分，故组织工程支架的趋向采用复合材料。通过蛋白质和多糖基质的交联，形成复合支架材料具有仿生的意义，可以保留单基质材料的性质，且可以改进单组分的不足。

采用冻干法(还称为：相分离法)，可制备蚕丝素蛋白-海藻酸盐复合固体支架，具体步骤包括：

第一，蚕丝素蛋白水溶液的制备：将蚕茧在Na₂CO₃溶液中溶解，用去离子水冲洗过滤，脱去丝胶。然后将脱胶好的蚕丝素蛋白在70℃溶解在LiBr/C₂H₅OH/H₂O的混合溶液中。将此溶液透析脱去盐，得到蚕丝素蛋白水溶液。

第二，蚕丝素蛋白-海藻酸钠支架材料的制备：将2wt%海藻酸钠水溶液和丝素蛋白水溶液按一定比例混合，得到2wt%的丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液。然后将混合溶液在零下20℃冷冻24 h，得到冻干的支架材料。随后将该材料浸入含有乙醇和10 wt%氯化钙的凝固浴中48 h，用离子水除去材料中残留的盐离子，将材料冷冻干燥就得到蚕丝素蛋白-海藻酸钠固体支架材料。

组织工程用丝素-海藻酸钠复合纤维固体支架材料，制备方法有: 热致相分离法和静电纺丝方法。

采用上述方法，均不能制备可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐水凝胶。

发明内容

本发明的一个目的是提供可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶。

本发明的可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶，包括溶液A蚕丝素蛋白溶液和溶液B改性海藻酸盐溶液，其中溶液A中：各组份的重量份为：蚕丝素蛋白：1.0ⅹ10^-1～3.0份，二价金属离子交联剂：1.4ⅹ10^-3～2.0 x10^-3份，其余为水，含蚕丝素蛋白1～5 wt%；溶液B中：各组份的重量份为：海藻酸盐：5.0ⅹ10^-1～4.0份，羧基活化交联剂：2.5ⅹ10^-3～4.0x10^-1份，其余为水，含海藻酸盐1～5 wt%。