[发明专利]快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的专用引物及其鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的专用引物及其鉴别方法。 

背景技术

马属动物的两种裸头绦虫: 叶状裸头绦虫(Anoplocephala perfoliata)和大裸头绦虫(A. magna)寄生于马属动物的大小肠中，世界性分布，在我国各地均有报道，特别在西北和内蒙古牧区，经常呈地方性流行。虫体寄生的部位可引起粘膜发炎和水肿，粘膜损伤，形成组织增生性的环形出血性溃疡，一旦溃疡穿孔，便引起急性腹膜炎，导致死亡。大量感染叶状裸头绦虫时，回、盲、结肠均遍布溃疡。回盲狭部阻塞，发生急性卡他性肠炎和粘膜脱落，往往导致死亡。重度感染大裸头绦虫时，可引起卡他性或出血性肠炎。临床可见消化不良，间歇性疝痛和腹泻，并引起增进性消瘦和贫血。进行粪便检查，可发现大量虫卵或孕节。虫卵或孕节特征几乎完全一致，依靠形态特征很难加以鉴别。绦虫病严重影响了畜牧业经济的健康发展。因此，加强马属动物的裸头绦虫病流行区绦虫的虫种鉴定及流行病学调查，明确各地区裸头绦虫的优势虫种，指导有关部门制定正确的预防、控制和净化措施以及对临床患者进行科学有效的治疗均具有重要意义。 

目前的诊断方法只能结合临床症状，通过粪便检查，观察是否有虫卵或孕节。此方法不能区分是哪种绦虫感染，也不能对感染虫种进行确诊。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的方法，确定感染的优势裸头绦虫，为裸头绦虫病的流行病学调查和临床诊断提供技术保障。为此，本发明还提供快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的专用引物。 

    本发明提供了快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的专用引物，所述引物为：上游引物为5’-GCAGAGTTTTGCTGATTTTATGAAG-3’，下游引物为5’-CCACTATACTCAGTATTAAATCCACTAACAAG -3’。 

    本发明还提供快速鉴别诊断马属动物裸头绦虫病的专用引物，所述引物为：上游引物为5’-GCAGAGTTTTGCTGATTTTATGAAG-3’，下游引物为5’-CCACTATACTCAGTATTAAATCCACTAACAAG -3’。 

    本发明的第三个目的是提供寄生于马属动物的裸头绦虫的NAD1核苷酸序列，所述裸头绦虫为叶状裸头绦虫和大裸头绦虫，所述叶状裸头绦虫的NAD1核苷酸序列参见SEQ ID No.1，所述大裸头绦虫的NAD1核苷酸序列参见SEQ ID No.2。 

    本发明的第四个目的是提供快速鉴别寄生于马属动物的裸头绦虫的方法，应用权利要求2中所述引物对裸头绦虫的NAD1进行PCR扩增，测序，测序结果与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的序列比对，若待测样品的核苷酸测序结果与叶状裸头绦虫核苷酸序列相似性高，则为叶状裸头绦虫；若核苷酸测序结果与大裸头绦虫核苷酸序列相似性高，则为大裸头绦虫。 

    优选地，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min。 

优选地，所述裸头绦虫的NAD1从孕节或虫卵中提取。 

所述从虫卵中提取裸头绦虫的NAD1的方法是先用沉淀法收集再用漂浮法收集。 

    优选地，步骤如下： 

1)      应用权利要求2中所述引物对裸头绦虫的NAD1进行PCR扩增，获得PCR产物；

2)      经琼脂糖凝胶电泳，回收PCR目的产物，将PCR目的产物与T-easy载体在16℃连接过夜，转染JM109感受态细胞；

3)      挑选单菌落培养，PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测序结果与两种绦虫各自特有的核苷酸序列进行比对，若待测样品的核苷酸测序结果与叶状裸头绦虫核苷酸序列相似性高，则为叶状裸头绦虫；若核苷酸测序结果与大裸头绦虫核苷酸序列相似性高，则为大裸头绦虫。

本申请人通过对叶状裸头绦虫或大裸头绦虫基因组DNA提取、线粒体测序，获得了叶状裸头绦虫和大裸头绦虫的NAD1核苷酸序列，参见序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。选取保守的序列区域设计引物，扩增的目的产物大小应为507 bp。 

本申请人首先对未知样品进行基因组DNA提取、PCR扩增目的片段和测序。然后用DNAStar 软件将测序结果与我们提供的叶状裸头绦虫和大裸头绦虫的NAD1核苷酸序列分别进行比对，根据序列相似性的高低确定裸头绦虫的种类。