[发明专利]干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化和检测分析方法

说明书

技术领域

    本发明属于检测分析领域，具体涉及一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化和检测分析方法。

背景技术

马铃薯是我国的主要经济作物，年产量近8000万吨。甘肃省作为我国马铃薯主产区，占全国总产量近25%。然而马铃薯块茎在贮藏期间极易受到镰刀菌(Fusariumspp.)的侵染而发生干腐病，西北主产区的发病率为15-25%。本申请人研究发现，Fusarium sulphureum是引起甘肃省马铃薯块茎干腐病的最主要病原菌，它不仅给马铃薯产业带来巨大的经济损失，而且由于块茎体内会积累大量的真菌毒素，主要以单端孢霉烯族毒素A型（T-2、DAS）和B型(Fus-X、3ADON)为主，该类毒素具有对人畜的潜在致癌危害。

单端孢霉烯族毒素在干腐病马铃薯块茎中的存在，不仅降低了块茎的食用安全性，而且会随带病块茎的加工进入马铃薯全粉和淀粉制品中，由于其在高温条件下非常稳定，加工过程中很难失活,因此带来了很大的安全隐患。因此，检测A（T-2、DAS）和B型(Fus-X、3ADON)单端孢霉烯族毒素在干腐病马铃薯块茎中的存在情况，对保证马铃薯块茎食用安全是非常必要的。

目前单端孢霉烯族类毒素常采用的检测方法基本上分为免疫化学分析法和物理化学检测法两大类。免疫化学分析法主要包括酶联免疫吸附法、免疫亲和层析法和放射免疫法等，该法具有特异性高、敏感性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，但检测结果易出现假阳性，且要制备用于ELISA的高效、特异的单抗或多抗，需要一个复杂的过程；物理化学检测主要包括薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。薄层色谱法是我国及其他许多国家的标准方法，但其操作比较繁琐、有机溶剂用量较大、准确度低等缺点。气相色谱法虽然可以对A型和B型单端孢霉烯族类毒素进行同时检测，需要进行衍生，操作繁杂。液相色谱法是真菌毒素类物质检测最常用的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种A型和B型单端孢霉烯族类毒素同时提取、纯化和检测的方法，主要针对A型T-2，DAS和B型Fus-X, 3ADON的检测，以解决现有气相色谱和高效液相色谱检测中存在杂峰较多，受基质干扰严重的问题。

本发明是这样来实现的：一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，包括以下步骤：

A、样品预处理：选取外观整齐，无病虫危害的马铃薯块茎，消毒，然后用无菌水冲洗，过夜晾干；然后在马铃薯块茎上打2-3个接种孔，去除其中的块茎组织，立即向接种孔中接种硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）的菌饼，被接种的马铃薯置于无菌塑料袋中5℃温度下孵育60d，接着切取马铃薯块茎的病部组织，置于零下80℃的冰箱中冷藏待用；

B、 样品的提取：取出冷藏的霉心病病部组织，粉碎后称取5.0g于50mL的离心管中，加入25mL乙腈水溶液（乙腈与水的体积比为84:16），漩涡均质3min，4℃温度下离心5min，离心机最大相对离心力为11000×g，上清液过滤转入150mL容量瓶中，下层沉淀用如上的方法重复提取两次，合并前3次的上清液于圆底烧瓶中，在60℃温度下旋转蒸发至近干，再用氮气流吹干，接着用4mL乙腈水溶液（乙腈与水的体积比为84:16）溶解，经规格为4mL的priboFast M270的净化柱进一步纯化，将待纯化液体转入净化柱中，然后在30s之内迅速推下活塞，让溶液通过净化柱，得洗脱液；再将洗脱液减压旋转蒸发至近干，残留物通过氮气流吹干后复溶于1mL的流动相中，最后通过0.22微米的微孔滤膜，上机待测。

优选地，步骤A样品预处理中马铃薯块茎用0.5%的次氯酸钠表面消毒。

优选地，步骤A样品预处理中马铃薯块茎的接种孔位置在果实的径向中部，接种孔的深度1cm，直径0.8cm。

优选地，步骤A样品预处理中硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）的培养基为PDA培养基（现有马铃薯葡萄糖琼脂培养基），培养7天，菌饼的细菌菌落总数达到1×10⁵ CFU/mL。

优选地，步骤A样品预处理中接种量为20微毫升。