[发明专利]干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化和检测分析方法

权利要求书

1.一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、样品预处理：选取外观整齐，无病虫危害的马铃薯块茎，消毒，然后用无菌水冲洗，过夜晾干；然后在马铃薯块茎上打2-3个接种孔，去除其中的块茎组织，立即向接种孔中接种硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）的菌饼，被接种的马铃薯置于无菌塑料袋中5℃温度下孵育60d，接着切取马铃薯块茎的病部组织，置于零下80℃的冰箱中冷藏待用；

B、样品的提取：取出冷藏的霉心病病部组织，粉碎后称取5.0g于50mL的离心管中，加入25mL乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为84:16，漩涡均质3min，4℃温度下离心5min，离心机最大相对离心力为11000×g，上清液过滤转入150mL容量瓶中，下层沉淀用如上的方法重复提取两次，合并前3次的上清液于圆底烧瓶中，在60℃温度下旋转蒸发至近干，再用氮气流吹干，接着用4mL乙腈水溶液溶解，乙腈与水的体积比为84:16，经规格为4mL的priboFast M270的净化柱进一步纯化，将待纯化液体转入净化柱中，然后在30s之内迅速推下活塞，让溶液通过净化柱，得洗脱液；再将洗脱液减压旋转蒸发至近干，残留物通过氮气流吹干后复溶于1mL的流动相中，最后通过0.22微米的微孔滤膜，上机待测。

2.根据权利要求1所述的一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于：步骤A样品预处理中马铃薯块茎用0.5%的次氯酸钠表面消毒。

3.根据权利要求1所述的一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于：步骤A样品预处理中马铃薯块茎的接种孔位置在果实的径向中部，接种孔的深度1cm，直径0.8cm。

4.根据权利要求1所述的一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于：步骤A样品预处理中硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）的培养基为PDA培养基培养7天，菌饼的细菌菌落总数达到1×10⁵ CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的提取纯化方法，其特征在于：步骤A样品预处理中接种量为20微毫升。

6.一种干腐病马铃薯块茎中单端孢霉烯族毒素的测定方法，其特征在于它包括以下步骤：

采用UPLC-MS/MS对权利要求1步骤C提取的样品检测，色谱分离柱BEH C18柱，流动相A是乙腈，流动相B 含10mM NH₄COCH₃和0.1%甲酸的水溶液，线性梯度洗脱4.8min内从A/B体积比为35/65达到A/B体积比为90/10，之后0.2min内由A/B体积比为90/10降到A/B体积比为35/65，保持1min，流速0.3mL/min，注射体积5微毫升，柱温和样品温度分别为35℃和4℃；

质谱条件：离子化模式，电喷雾电离正离子模式ESI+和负离子模式ESI－；质谱扫描方式，多反应监测MRM；毛细管电压，3.2 kV(ESI⁺、ESI^－)；离子源温度为110℃，去溶剂气温度为350℃；锥孔反吹气流速：50L/h；去溶剂气流速：500L/h；碰撞气压力：3.2×10³mbar。