[发明专利]突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用

说明书

分案说明

本申请系2013年1月7日提交的申请号为2013100052529，名称为一种筛查HRDs致病突变的方法及涉及的基因芯片杂交探针设计方法的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用。

背景技术

遗传性视网膜疾病(Hereditary retinal diseases,HRDs)是一组由遗传缺陷引起的进行性视网膜退行性疾病，是临床上常见且危害严重的遗传性致盲疾病。作为世界范围内工作年龄人群的第一大致盲眼病，HRDs在欧美发病率约为1/3000，在我国更是高达1/1000。我国是HRDs遗传资源大国，但目前HRDs相关的遗传学信息多来自西方国家，因此对我国HRDs患者进行深入的遗传学研究显得尤为重要。

HRDs多为单基因遗传病，众多基因缺陷均可导致其发生，其常见的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X连锁隐性遗传。迄今，全世界已鉴定出191个HRDs相关致病基因和231个连锁位点(www.RetNet.org)，且随着研究深入，该数目正逐年递增。其致病基因数之多表明临床表现相同的患者，很有可能有不同的基因型，即显著的遗传异质性。目前仍有大于60%(西方国家统计结果，我国比率更高)HRDs患者的致病基因尚未找到，提示存在大量新致病基因有待挖掘。

由DNA转录得到的前体RNA(pre-mRNA)需经过剪接成为信使RNA(mRNA)才能进一步参与翻译过程合成蛋白质，而该剪接过程主要发生在剪接体。剪接体是由小分子核糖核蛋白(snRNPs)组成的超大分子复合体，构成剪接体的snRNP有五种：U1、U2、U4/U6和U5。研究指出，与前体RNA剪接体蛋白编码相关的基因(剪切基因)能够引起常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)。目前已被证实能够引起ADRP的剪切基因有PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9以及由申请人所发现并报道的SNRNP200，这些剪切基因都是通过影响U4/U6-U5复合体而引起ADRP的。值得关注的是，上述六个剪切基因所编码的蛋白在生物体各种细胞内广泛表达，但目前研究仅发现该六个基因相关的突变能够引起视网膜疾病，没有引起其他疾病的报道。因此，针对剪切基因与RP发病的相关研究显得尤为必要。

针对HRDs的研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究HRDs致病基因的一个重要目的是进行HRDs分子诊断，鉴于其显著的遗传异质性，如何检测众多致病基因突变是目前的难题之一。基于连锁分析的定位克隆策略是鉴定单基因遗传病致病基因的经典方法，但是同时也面临一些困难：①通常需要多代家系，难以分析小家系和散发病例。②有时多代家系也不能定位致病位点。③难以在连锁区域内筛选出正确的致病基因。因此，鉴于HRDs疾病本身的性质及传统分析技术的局限性，寻求一种全新的HRDs致病基因的研究方法显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种以深度测序为平台筛查或检测HRDs致病突变所涉及的基因芯片杂交探针的设计方法，包括：

(1)候选基因的选择:所述的基因捕获芯片涵盖了全部179个由RetNet公布的视网膜疾病相关基因，及高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因；

(2)转录本的选择：针对不同基因选择特定转录本，选择原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本；

(3)杂交探针的设计：根据(2)中挑选出的不同转录本设计杂交探针，设计标准为：(a)探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；(b)去除在人类基因组中出现的高度重复序列及出现2-5倍的较低频率的重复片段；(c)对临近外显子的探针进行整合，整合标准为：当相邻外显子的综合目标区域总和小于600bp时，即将其整合为一个探针，以求通过一对探针完成多对外显子区域的捕获；其中，所述的相邻外显子的综合目标区域指前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止；(d)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游100bp的内含子的基础上，各继续增加相同bp数的内含子，使探针大小达到250bp。