[发明专利]HLA-B*58:01等位基因检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种HLA-B*58:01等位基因的检测方法，以及用于该方法的试剂盒，尤其涉及采用实时定量荧光聚合酶链反应技术对HLA-B*58:01等位基因的检测，并将检测结果应用于临床上指导别嘌呤药物使用的方法与试剂盒。

背景技术

药物不良反应（adverse drug reactions,简称ADR）,按照WHO国际药物监测合作中心的规定，系指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。药物不良反应，是病患者治疗过程中的巨大隐患。据统计，每年全世界死于不合理用药的人群总数量达1900万人。在美国每年有220万人在服用处方药后会产生副作用。其中死亡的病例超过了10万，每年用于治疗药物副作用的支出就达40亿美元。在我国，因药物不良反应住院的病人每年约250万人，直接死亡20万人。用药安全已经成为医学界的热点问题。

HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。在骨髓干细胞移植中最主要的排斥反应是移植物对宿主疾病(Graft Versus Host Disease,GVHD)，这主要是由于移植物中的免疫活性细胞(T细胞)识别并对移植物受体中的HLA和次要组织相容性产生反应的结果。因此在建立骨髓库以及移植手术前必须进行分型。

近年的研究发现HLA的部分等位基因与某些药物引起的不良反应密切关联。如美国白种人群中的卡马西平-药物超敏综合征（CBZ-HSS）关联性研究结果表明：HLA-B*0801、HLA-DR3和HLA-DQ2等位基因与CBZ-HSS具有相关性；HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇引发的严重皮炎副反应（Stevens-John综合征及中毒性表皮坏死症）呈现很强的相关性。尤其在汉族人中，几乎所有副反应的患者都是HLA-B58:01的携带者。HLA等位基因的分型检测可识别特定的HLA多态基因型。通过已知的多态基因型与药物疗效及毒性的关系，指导相关疾病的给药，对规避药物不良反应，倡导安全用药有着重要的影响与意义。

目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要有PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)法、PCR-SSP(Sequence-specific primers)法和PCR-SBT(Sequence-Based Typing)法。其中，PCR-SBT测序方法更是现世界卫生组织（WHO）推荐的HLA分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高，特异性强，样本需求量少等优点。但是，拥有众多优点的同时，此类方法也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂等缺点。尤其，操作繁琐，耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要，不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有着操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点将FQ-PCR应用于HLA等位基因的分型检测是PCR技术领域的一项创新。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种HLA-B*58:01等位基因检测方法及其试剂盒，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的一个目的是提供一种HLA-B*58:01等位基因检测方法，该方法包括如下步骤：

（1）提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

（2）通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

（3）使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

（4）测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量。

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b；