[发明专利]HLA-B*58:01等位基因检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种HLA-B*58:01等位基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

（2）通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

（3）使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

（4）测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量；

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b；所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组，其中：

核酸扩增体系Ⅰ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物1和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系I中所使用的寡核苷酸探针为探针1和探针4；

核酸扩增体系Ⅱ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物3和引物4，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系II中所使用的寡核苷酸探针为探针2和探针4；

核酸扩增体系Ⅲ中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物5和引物6，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系III中所使用的寡核苷酸探针为探针3和探针4；

各引物和探针具体组成如下：

引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，

引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，

引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，

引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，

引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，

引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，

引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，

引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；

探针1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

探针2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，

探针3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，

探针4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。

5.一种用于HLA-B*58:01等位基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：（1）分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，（2）分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中：

反应液1由如下组分组成：由PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物1和引物2，寡核苷酸探针为探针1；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；

反应液2由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；

反应液3由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物5和引物6，寡核苷酸探针为探针3；用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4；

EZ Taq混合液：主要成份为热启动Taq酶；

标准液1：纯合型HLA-B*58:01基因组DNA；

标准液2：杂合型HLA-B*58:01基因组DNA；

各引物和探针具体组成如下：

引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，

引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，

引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，

引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，

引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，

引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，

引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，

引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；

探针1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，

探针2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，

探针3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，

探针4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。