[发明专利]抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法以及利用该生物反应器制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的方法，通过建立能够特异性表达针对丙型肝炎病毒基因组的干扰核糖核酸(siRNA)的乳腺生物反应器，为治疗丙肝的siRNA药物的研制和生产奠定基础。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus)简称丙肝病毒(HCV)，于1978年被发现，其由外壳和其中的单链RNA组成。1989年，HCV基因组序列被首次获得。HCV主要经血源传播，此外还可以通过其他方式传播，如母婴垂直传播和性传播等。HCV感染可引发丙型肝炎，但发病机理仍不十分清楚。临床观察资料表明，人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，临床上50％的丙型肝炎病人可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会发展为肝硬化及肝细胞癌。

目前尚无针对丙型肝炎的疫苗，唯一的预防措施是防止血液接触。被发现感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干扰素α-2a或α-2b(peginterferon)联合病毒唑(ribavirin)治疗。这也是迄今为止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干扰素与病毒唑单独和/或联合使用治疗丙型肝炎带来的毒副作用不容忽视，其在适宜人群和与其他药物联用方面也面临诸多限制。

近年来出现了多种辅助抗病毒药物治疗的新型技术，包括核酶技术、细胞内干扰性多肽或蛋白质疗法，以及DNA免疫疗法等。其中，核酶(ribozyme)技术是指通过人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的单链RNA分子，例如发夹状核酶，与靶RNA中的互补序列特异性结合进而进行切割。在上述新型技术中，小干扰核糖核酸(small interfering RNA，缩写为siRNA)药物又是一大热点。RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导人与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解，从而导致基因表达沉默。此现象可对外来基因材料，如转位子、病毒等对基因组的破坏起到防御作用。通过RNAi机制，siRNA可特异性地、有效地沉默靶基因。已有研究证明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表现出抗病毒作用(Nat.Biotechnol.21(6)：639-644(2003)；S.B.Kapadia，et a1.Interference of hepatitis C virus RNA repli cation by short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)：2014-2018(2003)；J.A.Wilson.et al.RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(5)：2783-2788(2003)；A.P.McCaffrey，et a1.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.G.A.Coburn and B.R.Cullen.Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type1replication by RNA interference.J.Virol.76(18)：9225-9231(2002))。

虽然使用siRNA治疗丙肝的疗效前景乐观，但仍需克服诸多方面的技术难题，包括siRNA的靶向性有效释放、siRNA的制备等。目前，制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶切长链dsRNA法、siRNA表达载体法和PCR表达框法。这些方法普遍存在产出率较低、生产成本较高的缺点。