[发明专利]抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法

权利要求书

1.一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；

(3)利用步骤(2)制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体还包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、sl-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受精卵细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒；

(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导入乳牛受精卵细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛胚胎干细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛；优选地，可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系。

6.一种抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导人受体细胞，所述受体细胞为乳牛受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；

(3)利用步骤(2)制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛；

(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述载体还包含一种或多种选自半乳糖基因启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子、sl-酪蛋白基因启动子、乳清酸蛋白启动子和乳清蛋白基因启动子的基因序列。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛受精卵细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛；

(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的逆转录病毒载体；优选地，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸连接在逆转录病毒DNA的LTR下部；更优选地，将逆转录病毒载体包装成高滴度病毒颗粒；

(2)将步骤(1)构建的逆转录病毒载体导入乳牛受精卵细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛受精卵细胞置于假孕乳牛输卵管中发育并获得转基因乳牛；

(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。

10.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；

(2)将步骤(1)构建的载体导人乳牛胚胎干细胞；

(3)将步骤(2)制得的乳牛胚胎干细胞与乳牛胚囊细胞混合(例如通过囊胚腔注射混合)，置于假孕乳牛子宫中发育并获得转基因乳牛；优选地，可以再利用生殖系嵌合子代设计进行交配育种获得纯系；

(4)从步骤(3)制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。