[发明专利]一种检测柑桔黄脉病毒的引物对及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种柑桔黄脉病毒的引物对及快速检测方法。

背景技术

柑桔黄脉病（Citrus yellow vein clearing disease,CYVCD），也称柠檬黄脉病（Yellow vein clearing of Lemon），是由柑桔黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起的。该病是Bové（1989）在巴基斯坦调查发现后命名的，它是威胁柠檬生产的重要病害之一。主要症状表现为叶片侧脉及侧脉附近脉明、黄化，对光看更为明显，叶背可见侧脉处水浸状，部分叶片皱缩、反卷或船形叶，嫩叶症状表现明显，到老叶症状也不消失。主要导致光合作用降低、树势减弱、减产20%左右。柠檬黄脉病目前主要发生在印度、巴基斯坦、土耳其等国家。近年在我国云南瑞丽、重庆也发生类似症状，是我国柑桔上的新发病害。

到目前为止，世界上对该病害的研究较少，大都停留在生物学特性研究方面，本人近几年研究结果表明该病害具有嫁接传染性，对所有柠檬、酸橙品种都具有嫁接传染性并具典型症状，对甜橙、宽皮柑桔也具有侵染性，但症状不明显；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黄脉病最适宜发病温度为18～24℃，柑桔黄脉病病毒微粒为13～15×400～1000nm联合丝状，通过热处理结合茎尖嫁接脱毒方法能有效脱除该病毒。这些研究结果与国外研究报道的相关结果相同。

但由于通过指示植物鉴定具有时间长，工作量大，不利于田间样品的大量检测。且到目前为止，国内尚无RT-PCR快速检测柑桔黄脉病毒的方法报道。

发明内容

本发明的目的是建立一种柑桔黄脉病毒快速检测方法。该方法具有速度快、成本低、重复性好、稳定性高、操作性强等特点，适合大规模、高通量的样品分析，适用于田间样品检测、柑桔黄脉病流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。

本发明的目的是这样实现的：

本发明目的之一，根据已报道的柑桔黄脉病毒全序列设计特异性引物对：

上游引物：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’

下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’

总核酸提取及(RT)-PCR扩增所需试剂如下：

RNAiso Plus1ml，氯仿200μL，异丙醇，75%乙醇，DEPC水，2×Buffer液5μL，MgSO40.3μL，RT/Taq酶0.2μL，正反引物各0.2μL，灭菌去离子水2.1μL。

(RT)-PCR扩增条件为：42℃，30min；94℃，2min；94℃，30S，55℃，30S，72℃，40S，40个循环；72℃，5min。

本发明的目的还在于提供一种柑桔黄脉病毒检测的试剂盒，包括下列引物对：

上游引物：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’

下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。

本发明的目的还在于提供一种快速检测柑桔黄脉病毒的RT-PCR的检测方法，包括如下步骤：提取柑桔样品总核酸，设计特异性引物，对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定：

所述RT-PCR扩增所需试剂如下：

RNAiso Plus1ml，氯仿200μL，异丙醇，75%乙醇，DEPC水，

2×Buffer液5μL，MgSO40.3μL，RT/Taq酶0.2μL，正反引物各0.2μL，灭菌去离子水2.1μL；

RT-PCR扩增条件为：程序为42℃，30min；94℃，2min;94℃，30S，55℃，30S，72℃，40S，40个循环；72℃，5min。

优选的，所述提取样品总核酸，样品主要取春、秋梢嫩叶叶脉及附近组织。

所述电泳鉴定得到的特异性片段大小为612bp。

本发明具体按如下步骤进行：

1、总核酸提取：

（1）取样、研磨：

由于CYVCV症状主要表现春季和秋季的叶片上，尤其在嫩叶上，故采样嫩叶叶脉及附近组织10-15mg装于无菌eppendorf管，液氮研磨；