[发明专利]牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛胴体性状候选基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

ANK1（Ankyrin1）基因属锚蛋白基因家族（Ankyrins），编码的AnkR蛋白存在于肌肉中的肌原纤维之间和肌原纤维与肌膜之间，ANK1基因在人类医学领域研究较多，人类ANK1基因启动子区的碱基缺失与遗传性球形红细胞增多症相关，在ANK1启动子区域的碱基突变与日本人患2型糖尿病的易感度相关。ANK1基因与肌内脂肪关系的研究在猪和牛上有所报道，安格斯牛、夏洛来牛和利木辛牛ANK1基因1.11kb的启动子区域发现了7个多肽位点，其中5个SNPs与肌肉嫩度和大理石花纹相关，两个单倍型与肌肉嫩度相关；1个单倍型明显与肌内脂肪和肉的多汁性相关。皮特兰猪、杜洛克猪和大白猪ANK1基因启动子761bp区域发现了12个SNP，其中2个SNPs与肉质性状显著相关。1个SNP和1个单倍型与肌肉滴水损失相关而另一个SNP与肌内脂肪性状相关，在大白猪中1个单倍型与肌内脂肪相关，单倍型3在皮特兰中发现与失水率有关。单倍型5是与大白猪的肌内脂肪和肉质的滴水损失成正相关。猪ANK1基因3′UTR的一个SNP与肌肉剪切力、肌内脂肪及肌肉持水性相关。

ANK1基因已经成为肉质改良中最为主要的肉质候选基因之一。牛的ANK1基因图谱已经绘制完成，此基因在牛的第27号染色体上，与肉质脂肪和大理石纹等数量性状位点相邻。猪的ANK1基因在17号染色体上，其紧邻体重、背膘厚度和肌间脂肪等数量性状位点。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低，用于牦牛胴体性状候选基因分子选种技术。

本发明的又一目的在于一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法。

通过PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体ANK1基因第1外显子-第1内含子区进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合胴体性状相关的生产数据，确定对胴体性状影响显著的等位基因，为改善牦牛生产性能提供指导。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于：

ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'；

ANK1-R:5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'。

一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，ANK1*B的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；（补充数量）

所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F:

5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'和ANK1-R:

5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，1.0μL，ddH₂O补充体积至20μL；

一种牦牛胴体性状候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于，检测步骤如下：

（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；

（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；

（3）聚合酶链式反应：

PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ANK1-F和ANK1-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃7min；

引物序列为：

ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3'