[发明专利]一种使用重组耶氏解脂酵母菌株生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

【背景技术】

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是由一系列含有共轭双键、具有位置和几何异构的十八碳二烯酸的总称，是必需脂肪酸亚油酸（Linoleic acid，LA）的立体几何异构体，也可看作是亚油酸的次生衍生物。CLA具有多种异构体形式，其中cis-9，trans-11-CLA（c9，t11-CLA）、trans-10，cis-12-CLA（t10，c12-CLA）两种异构体是含量最多并且确认具有生理活性功能的共轭亚油酸单体。CLA作为一种新型的脂肪酸，其生理功能已逐渐被人们所认同。CLA具有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统调节以及抑制脂肪积累等对人类健康有益的效果，并且CLA能够提高饲料效价防霉变作用而被广泛的研究。

因为CLA具有多种独特的生理功能，被誉为“21世纪的新型营养素”，越来越多地引起了世界各国政府及科研工作者的重视，美国、加拿大等国已经开始把CLA作为营养添加剂大量用于农业及食品工业。CLA正成为药物、食品、饲料等研究领域的一个热点。由于天然CLA主要存在于反刍动物乳制品中，含量非常低；而通过碱催化异构化等化学方法合成的CLA是多种异构体的混合物，较难分离纯化具有活性功能的异构体；所以，研究生物转化法获得成分单一的功能CLA具有重要的现实意义。

到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高产量是Shimizu研究小组通过Delacroixia coronata菌株的delta-9脱饱和酶作用，以33.3mg/mL异油酸（trans-11-octadecenoic acid，t-OA）为底物转生产了10mg/mL的CLA，其中98%为c9，t11-CLA；而t10，c12-CLA生物合成的最高产量是江南大学食品生物技术中心陈卫研究小组构建的重组耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通过添加20g/L大豆油，在5L发酵罐中发酵38.5h得到CLA的最高产量为4g/L，其中全部为t10，c12-CLA。由于CCFM-JU277-9能够在胞内合成亚油酸异构酶（PAI），并催化LA形成专一的t10，c12-CLA单体形式，因此增加底物LA的含量将有助于增加t10，c12-CLA的产量。

因此，本发明希望通过在培养基中添加LA含量较高的廉价植物油、优化植物油的添加时间及添加量，从而实现提高t10，c12-CLA产量的目标。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物；

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养，在发酵0-45小时期间添加终浓度为10～70g/L的乳化植物油，震荡培养48～100小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；

所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

D、由菌体提取脂肪