[发明专利]一种提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌耐热元器件的构建方法及其与底盘宿主的集成，实现分子水平上调控大肠杆菌耐热性，属于生物化工领域。

背景技术

微生物耐热性是决定发酵过程能量消耗和产物合成效率的重要因素。在利用微生物发酵生产生物制品的过程中，细胞新陈代谢释放出大量的热，发酵体系逐渐升温，无法自行降到反应所需的最适温度，所以需消耗大量冷却水控温，导致动力费用增加、发酵过程高能耗的问题。但与之矛盾的是，胞内大多数酶最适反应温度都高于最适生长温度，从反应热力学角度分析，提高温度可以有效地活化反应过程，加速代谢传质，提高细胞合成效率。所以提高发酵菌株耐热性，扩宽最适生长温度的范围将很好的解决这一矛盾，同时能够大幅度降低成本，提高生产效率。

大肠杆菌的基因操作简单，易于培养，生产成本低，是工业生物技术应用最广泛的工业生产菌株之一。因此，提高大肠杆菌的耐热性是获得低成本生物制品的有效途径。目前研究中，主要通过高温筛选或驯化的方式提高大肠杆菌耐热性，但这种方法只能提高最适生长温度，无法扩宽最适生长温度范围，不能满足工业发酵逐渐升温的需求。对于分子层面上的研究，目前主要通过调控大肠杆菌自身一些转录因子或蛋白表达来提高耐热性，此方法受限于大肠杆菌本身的耐热机制，效果并不明显。而通过引入外源耐热机制分子水平上改造大肠杆菌的耐热性虽已有报道，但研究不系统，应用于工业梯度升温发酵还未见报道。

嗜热微生物大部分属古菌域，一般生活在地球上的极热环境中，代表了生命温度的极限，部分耐热的机理已经得到合理的阐述，比如特殊细胞膜组成成分、更紧密的蛋白质空间结构、热诱导转录因子、热激蛋白（HSP）等。其中产生大量热激蛋白是一种重要的分子调控手段，其不仅在热胁迫下能够有效的保护细胞，对于有机溶剂、酸性环境等胁迫也能发挥其生理生化功能。目前，将热保护机制中的关键的基因开发成具有耐热功能的分子元器件来改造大肠杆菌的耐热性，并且应用于工业生产的发酵过程还未见有文献报道。

基于近年来合成生物学快速发展，发掘了不同强度的耐热元器件并进行人工设计及优化，对大肠杆菌进行分子水平的调控，提高了其耐热性。应用于微生物发酵生产过程，将大幅度提高生产强度，降低成本。

发明内容

本发明的目的是通过提高大肠杆菌耐热性，解决其在工业发酵过程中由于控制常温发酵导致生产过程高能耗的问题，降低生产成本。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种构建耐热元器件及耐热大肠杆菌的方法，实现从分子水平上调控大肠杆菌的耐热性。从嗜热菌和耐热菌中通过克隆或人工合成得到一系列对细胞具有热保护功能的基因作为功能元件，如热激蛋白（HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、smHSP）、泛素和热诱导转录因子基因等，同时以大肠杆菌不同强度启动子和终止子作为调控元件，通过以下3种不同的组装方式构建耐热元器件。（1）以单个功能元件和调控元件组装成耐热元器件：启动子-功能元件-终止子。（2）针对耐热功能互作的功能元件共组装成簇状耐热元器件：启动子-功能元件1-功能元件2…功能元件n-终止子（n≥2）。（3）针对具有不同热保护功能的耐热功能元件组装成串联型耐热元器件：启动子1-功能元件1-启动子2-功能元件2…启动子n-功能元件n-终止子（n≥2）。将构建的所有耐热元器件连接载体后，转化大肠杆菌，实现耐热元器件与底盘宿主大肠杆菌的集成，以拓宽大肠杆菌的最适生长温度范围，提高其耐热性。通过梯度升温发酵及恒定高温发酵表征工程菌耐热性，根据耐热温度范围，将所有耐热元器件划分为强、中、弱三类，可实现大肠杆菌不同耐热程度的分子调控。

本发明的提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法，具有以下优点：

1、本发明构建的耐热元器件实现了大肠杆菌不同程度耐热性的分子调控，满足了不同发酵生产要求。

2、本发明构建的耐热大肠杆菌工程菌，简化了发酵工艺，降低了生产成本，达到节能减排的目的。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：单功能元件耐热元器件组装