[发明专利]赛庚啶半抗原、抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及赛庚啶半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

赛庚啶（Cyproheptadine）化学名称为1-甲基-4-（5H-二苯并[a,d ]环庚三烯-5-亚基）哌啶盐酸盐倍半水合物，别名塞庚定、二苯环庚啶、偏痛定，英文别名2,6-dichloro-N-(2-imidazolin-2-yl)aniline。分子式C21H21N·HCl·3/2 H2O；分子量：350.89。赛庚啶为白色或浅黄色结晶粉末，无臭、味微苦。熔点113℃。在甲醇中易溶；在氯仿中溶解，溶液有乳化现象（若以干燥品溶解，溶液即澄明）；在乙醇中略溶；在水中微溶，水溶液呈酸性反应；在乙醚中几乎不溶。赛庚啶为人用抗过敏药，对抗体内组胺对血管、支气管平滑肌的作用，从而消除过敏症状，也可用于改善患者的食欲。赛庚啶是一个典型的H1受体阻滞剂，属于抗组胺药，但同时也是5-羟色胺受体拮抗剂，可在下丘脑食欲中枢拮抗5-羟色胺，这可以解释赛庚啶具有刺激食欲的功能。赛庚啶易吸收，主要代谢物是葡萄糖醛酸苷季铵物，以及芳环羟基化、N-去甲基化和杂环氧化产物。赛庚啶常见的副作用为轻、中度的嗜睡、头昏、乏力、口干等，自2005 年起已在国内的饲料产品中发现添加，分析原因可能为通过促进动物食欲以达到增重的目的。食用含有赛庚啶残留的动物源性产品，对人体健康具有一定的危害性，对儿童的作用更为明显，高浓度可直接引发昏迷、呼吸急促、全身无力等中毒症状，严重者则直接导致儿童死亡。赛庚啶并不是一种饲料添加剂，世界卫生组织、我国、美国、欧盟及一些发达国家等都禁止违法使用赛庚啶。2010年12月农业部1519号公告已明确把赛庚啶列入了《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单。

目前国内外大多采用高效液相色谱法测定，这些方法特异性强、灵敏度高、但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。赛庚啶人工抗原的制备为这一方法的实施奠定了重要基础。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种赛庚啶半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。

本发明提供的赛庚啶半抗原，其结构为式Ⅰ所示：

本发明还保护式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

将赛庚啶，氯碳酸乙酯和甲苯的混合物回流，冷却后，用盐酸和水洗涤，干燥并浓缩；用正己烷处理，得到浅黄色结晶，重结晶，得到微黄色针状结晶；产物加入水和氢氧化锂(一水),pH试纸检测pH=10以上；室温水解反应后用乙酸乙酯萃取，萃取水解反应水相一到两次，除去杂质，再用盐酸调pH值到4左右，用乙酸乙酯萃取，旋干得到半抗原。

本发明所提供的赛庚啶抗原，是将赛庚啶半抗原与载体蛋白偶联获得的抗原。

所述赛庚啶抗原，其结构为式Ⅱ所示：

本发明还保护所述赛庚啶抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）取式Ⅰ所示产物 31.7mg，溶于3ml二甲基甲酰胺DMF中；

（2）加入1ml0.01M PBS助溶，加入碳二亚胺EDC38mg，N-羟基琥珀酰亚胺NHS38mg，室温活化2h；

（3）取载体蛋白100mg溶于10ml的0.1M碳酸氢钠溶液中，将活化物在4℃冰水浴条件下，加入到蛋白中，4℃搅拌反应过夜，置1L0.01MPBS中透析8次，以除去未反应的小分子物质；

（4）分装，于-20℃保存备用。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述赛庚啶抗原可以作为免疫原制备赛庚啶特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

式Ⅰ所示产物、所述赛庚啶抗原、所述抗体均可应用于检测赛庚啶。

本发明还公布了应用赛庚啶抗原和赛庚啶单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。

所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有赛庚啶抗原的酶标板、酶标抗体工作液、赛庚啶系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。