[发明专利]一种新型隐球菌检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种新型隐球菌检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的CN检测试剂盒。

背景技术

新型隐球菌（Cryptococcus Neoformans，CN）是一种可引起人类严重感染的酵母样病原真菌，主要引起细胞免疫功能低下者，如器官移植、长期应用激素及艾滋病(AIDS)患者并发隐球菌病。

新型隐球菌通常经呼吸道或皮肤黏膜破损处侵入人体，血行播散至脑、骨骼和皮肤。有80%病例中枢神经系统受损，引起慢性脑膜炎，此外，还可引起肺隐球菌病，以及其他感染，如侵害淋巴结、骨、皮肤等引起炎症、脓肿等。临床检测方法主要有墨汁染色、脑脊液细胞形态学检验、组织病理学方法等。墨汁染色和脑脊液细胞形态学检验、组织病理学方法均难以计数，且需进行创伤性操作，临床应用具有局限性。

近年来以DNA为基础的PCR分子生物学检测方法因快速、准确而倍受关注，成为探索的热点，主要包括巢式PCR（nest PCR）、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantify PCR）等。由于实时荧光定量PCR在速度、操作、特异性等多方面存在众多优势，因此临床上其中新型隐球菌感染早期诊断领域的应用愈加广泛，给临床诊断和治疗带来了重要的指导意义。

运用荧光PCR技术检测新型隐球菌DNA主要包括新型隐球菌核酸提取和核酸PCR扩增两方面。

目前国内临床上主要采用机械破碎法对新型隐球菌核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，反复高速震荡和高速离心，再取上清为模板。该方法的优点在于对于样本中的PCR抑制物去除较彻底，但存在步骤繁琐，操作时间长，对于操作人员技术水平要求高和需添置专门的设备等不足之处。

临床上检测CN-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

目前国外已有基于实时荧光定量PCR技术检测CN-DNA的试剂盒，但这些试剂盒的核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。且其检测灵敏度不高，某些弱阳性样本经常无法扩增。这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。另外，受限于现有技术中针对CN-DNA检测的引物探针序列，本领域还需要开发出一种检测CN-DNA特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明提供一种核酸释放剂在新型隐球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。

在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在CN检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该核酸检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。