[发明专利]西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。 

背景技术

西尼罗病毒病是一种烈性人畜共患传染病，会导致严重的公共卫生问题。西尼罗河病毒可以通过蚊或蜱等血媒介传播，大多缺乏有效的治疗和预防措施，给疾病控制提出了严峻的挑战。西尼罗病毒血清学诊断方法较多，但这些方法都有一定得局限性。比如ELISA不是特异诊断方法，只能用于病毒抗体的筛查，不能进行确诊；特异的蚀斑减少中和试验操作较繁，费时费力，难以应用于大规模普查。西尼罗病毒核酸检测方法主要有普通RT-PCR方法，但是其在检马脑组织病料时，敏感性差。此方法还有一个很大的缺点：就是易污染、易出现假阳性现象。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量西尼罗病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂和西 尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。 

本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括： 

引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′ 

WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′ 

探针：WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′ 

内标探针：WNV-PBIC：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′， 

所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。 

所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 

CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。 

所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。 

所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为： 

CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCC GTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。 

一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H₂O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液； 

其中，所述PCR混合液中包含： 

引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′ 

WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′ 

探针：WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′ 

所述假病毒内标溶液中包含：内标核苷酸序列制作的假病毒； 

所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团； 

所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 

CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。