[发明专利]利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基

说明书

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，更具体地，涉及用于培养海蟹共生曲霉的培养基技术领域，特别是指一种用于发酵培养海蟹共生曲霉（CY018，Aspergillus fumigatus）生产生物碱类选择性免疫抑制剂-烟曲霉文丙（Fumigaclavine C，通称FC）的培养基之制备方法及使用该培养基制备烟曲霉文丙的方法。 

背景技术

海洋是一个开放的复杂系统，在海洋特殊的生态环境下生活着40多万种动植物和上亿种微生物。近年来许多文献报导了海洋生物作为活性化合物和药物来源的巨大潜力，具有重要的研究意义与开发价值。为适应海洋特有环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，有些共生菌似乎与宿主形成了类似于“整体”的统一体，缺一难活。研究表明该“互惠共生”的化学本质是共生菌可产生结构和功能都比较特殊的代谢物，来保护或调节海洋生物的生长发育、抵御天敌、寻取食物等行为。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类急需新药的发现与研发提供广阔的空间。 

海洋来源内生真菌菌株编号：CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌，由南京大学谭仁祥教授分离得到。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。烟曲霉文丙是其产生的一种生物碱类次级代谢物，烟曲霉文丙纯品为白色针状结晶，其具有同环孢菌素A相媲美的免疫抑制活性，是一种潜在的免疫抑制剂候选药物。 

然而，烟曲霉文丙在初始发酵工艺下的得率相当低，已经成为制约烟曲霉文丙用于临床前研究的瓶颈。因此通过改善其发酵工艺提高烟曲霉文丙产量已成为当务之急。 

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对烟曲霉文丙深入研究的瓶颈问题，提供一种用于发酵海蟹共生曲霉生产选择性免疫抑制剂-烟曲霉文丙的培养基及其制备方法，及使用该培养基发酵生产烟曲霉文丙的方法；该培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，而使用该培养基发酵海蟹共生曲霉生产选择性免疫抑制剂烟曲霉文丙，能显著提高烟曲霉文丙的产量。 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种用于发酵培养海蟹共生曲霉生产烟曲霉文丙的培养基，每升所述培养基包含：糖蜜 50-150g/L、蔗糖40-80 g/L、硝酸钠 2-5 g/L、磷酸氢二钾 0.5-1.5 g/L、氯化钾 0.25-1 g/L、七水硫酸镁 0.25-1 g/L、硫酸亚铁 0.005-0.02 g/L、硫酸锌0.005-0.02 g/L、硫酸铜 0.001-0.01 g/L、色氨酸 0.5-1.5 g/L，以自来水溶解。

作为本发明的优选方案之一，每升所述培养基包含：所述糖蜜 90-130 g/L、蔗糖55-75 g/L、硝酸钠 3-4.5 g/L、磷酸氢二钾0.9-1.3 g/L、氯化钾 0.4-0.7 g/L、七水硫酸镁 0.4-0.7 g/L、硫酸亚铁 0.009-0.013 g/L、硫酸锌 0.009-0.013 g/L、硫酸铜 0.004-0.007 g/L、色氨酸 0.8-1.3 g/L、以自来水溶解。 

一种用于制备上述本发明所述培养基的方法，包括如下步骤： 

将所述糖蜜、蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、色氨酸准确称量后，以自来水溶解，并定容至1000 ml，使它们在培养基中的终浓度分别为50-150g/L、40-80 g/L、2-5 g/L、0.5-1.5 g/L、0.25-1 g/L、0.25-1 g/L、0.005-0.02 g/L、， 0.005-0.02 g/L、0.001-0.01 g/L、0.5-1.5 g/L，再以盐酸调节pH值至4.0-4.5，然后将所获得的培养基在121℃下灭菌15-30 分钟。

一种使用前述本发明所述培养基发酵培养海蟹共生曲霉生产烟曲霉文丙的方法，其操作步骤包括： 

a.将冷冻保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，在固体平板培养基中央进行点样并活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，固体平板培养基每隔30天重新活化一次；

b.从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块琼脂块，接种至种子培养基发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；