[发明专利]检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定与定量检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其检测方法。 

背景技术

由尖孢镰刀菌1号（Fusarium oxysporum f.sp.cubense race1，FOC1）和4号生理小种（F.oxysporum f.sp.cubense race4，FOC4）引起的香蕉镰刀菌枯萎病，是世界上香蕉的毁灭性病害，给世界的香蕉产业带来巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亚洲，年产量近一亿吨，是世界第二大水果作物，同时为近5亿人口的主要粮食之一，是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。日前共有120个国家和地区生产香蕉。近年来我国香蕉生产发展迅猛，居全球第二。香蕉业己成为我国热带地区农业的支柱产业。但是，随着香蕉种植面积逐年增加，香蕉病害的危害也日益严重，尤其是香蕉枯萎病给香蕉生产带来极大的威胁。1876年，Joseph Bancroft在澳大利亚首次报道了香蕉枯萎病。1904年在美国夏威夷也发现此病，1910年，巴拿马因香蕉枯萎病大发生，造成惨重损失，因而香蕉枯萎病又称为香蕉巴拿马病。同年，由Erwin F.Smith在古巴从香蕉病组织中分离到该病的病原菌，并将其命名为Fusarium oxysporum f.cubense E.F.Smith。1913年Ashby对该病害及其病原菌首次做了详细的描述，Brandes于1919年首次确证了该病菌的致病性，1940年由Snyder和Hansen建议将该病菌正式命名为F.oxysporum Schlecht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen。目前，该病害已广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区。该病（1号小种）于1940—1950在中南美洲国家爆发感染，使风糜世界的国际贸易香蕉品种大蜜哈（Gros Michel）退出历史舞台。1967年我国台湾省发生香蕉枯萎病,20世纪70年代后流行,使台湾的香蕉面积从最高峰时期的50000公顷降至近年的5000公顷,而且其中的一半仍受到枯萎病的影响。菲律宾、澳大利亚、马来西亚、非洲等国家和地区的香蕉也相继局部发生枯萎病。 

在中国于十九世纪五六十年代在广东、广西、海南发现该病侵染为害粉蕉，1996年广东番禺万顷沙镇的巴西及广东2号香蕉出现枯萎病，现已通过种苗和流水等传染途径扩散至中山、珠海、东莞、肇庆、信宜、高州和湛江（雷州半岛）等地，该病每年以30—50公里速度传播，使许多蕉园不能种植香蕉，目前已有1000多公顷蕉园弃耕。现广东、广西（如 南宁、百色）、福建（如漳州）、海南（如文昌、万宁、儋州、安定、澄迈）、云南（如河口、景洪）和台湾均有分布，对我国香蕉种植业构成严重威胁。 

该菌因生理小种不同而危害不同品种的香蕉，世界上已报道有3个生理小种，其中1号小种世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品种大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan Latundan(AAB)和IC2(AAAA)等香蕉品系；2号小种在中美洲洪都拉斯、萨尔瓦多、波多黎哥、多米尼加和维尔京群岛分布，仅感染杂种三倍体Bluggoe(ABB)及其近缘品种和某些Jamaica四倍体(AAAA)蕉；4号小种主要分布在澳大利亚、非洲以及菲律宾（卡拉雷群岛）等部分亚洲国家，可感染大蜜哈(AAA)、Taiwan Latundan(AAB)、Pisang Lilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品种及对其他小种有抗性的香牙蕉（AAA），故危险性和毁灭性最大，引起世界各香蕉种植国家的高度关注。目前中国以小种4号和1号危害最为严重。 

目前该病害没有好的防治措施，而且危害的区域在不断扩大，且对于粉蕉更存在FOC1侵染的现象。粉蕉经济价值高，且随着种植面积的增大，病害发生也日趋严重，对于粉蕉苗的检测和发病初期的早期检测而言，需要更为灵敏和准确有效的检测方法。对香蕉枯萎病及其病原的检测鉴定和监控防疫工作是解决香蕉枯萎病问题的前提和基础，检测方法的建立和应用对于阻止病害蔓延和发生具有重要的意义。 

国内的检测鉴定研究，如王国芬等根据香蕉枯萎病菌ITS序列设计合成的三条引物:FusF1(5′AACCCCTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)构成引物对A(FusF1/R1)和B(FusF1/R2),对尖孢镰刀菌古巴专化型病菌进行了有效的PCR特异扩增试验。