[发明专利]检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用

权利要求书

1.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1）的TaqMan 引物和探针，其中，所述的引物序列为：上游引物Foc1-0422F1 5’-AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT-3’ ，下游引物Foc1-0422R1 5’-AACTCCTTCACCAGCCTTTCG-3’，探针为5’荧光标记,3’淬灭剂标记的DNA序列，所述的序列为：Foc1-0422P1 5’-Dye-AGCATGGCAGGTCGT-Quen -3’。

2.根据权利要求1所述的探针，其中所述的荧光剂选自Biotin、Cy3、Cy5、Digoxin、FAM、HEX、JOE、ROX、TAMRA、Amino、Phosphorylation、ROX、SHC6、SIMA(HEX)、TET。

3.根据权利要求1所述的探针，其中所述的淬灭剂选自JOE、BHQ1、BHQ2、ROX、BHQ3、TAMRA、Biotin、BiotinTEG、Dabcyl、Dabsyl、TET、Digoxin、Amino、diThiol、Eclipse、FAM、HEX、Phosphorylation、SHC6、SHC3。

4.如权利要求1所述的引物和探针，其中所述的探针的为Foc1-0422P1 5’FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQ3 3’。

5.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4）的试剂盒，其特征在于包括引物和探针，所述的引物和探针的序列为：上游引物Foc1-0422F1 5’-AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT-3’ ，下游引物Foc1-0422R1 5’-AACTCCTTCACCAGCCTTTCG-3’，探针序列为：Foc1-0422P1 5’-Cy5-AGCATGGCAGGTCGT-BHQ3-3’。

6.如权利要求5所述的检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的试剂盒，其特征在于还包括实施荧光定量PCR所需要的其他试剂，具体为TaqMan Universal PCR Master Mix，包含尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种DNA片段的质粒模板，TE缓冲液。

7.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的探针和引物进行TaqMan荧光定量检测，具体方法包括： 

1）样品DNA提取采用CTAB两步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用Nano Drop1000型核酸微量测定仪测定核酸浓度。具体提取步骤如下： 

称取1g样品（根据样品的DNA含量，可以调整样品量），加入到50mL的离心管中；加入5mLCTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混匀，65℃孵育30min，不时振荡；65℃过夜后,8000r/min室温离心10min,取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000×g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中;加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μLNaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000×g离心10min，转 移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000×g离心10min，弃去上清，加入500μL70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μLTE溶液中； 

2）实时荧光PCR检测方法特异性验证 

使用荧光探针Foc1-0422P1及引物Foc1-0422F1/Foc1-0422R1进行实时荧光PCR，共同检测香蕉串珠镰刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龙果枯萎病菌等镰刀菌属内近似种及镰刀菌属外青霉属。扩增试剂盒采用ABI试剂盒2×TaqMan Universal PCR Master Mix II， 

实时荧光PCR反应体系如下： 

试剂名称 体积 TE缓冲液 8.25μL 引物(上游) 0.75μL 引物(下游) 0.75μL 探针 0.25μL TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL DNA模板(10-100ng/μL) 2.5μL 总体积 25μL

其中，仪器采用ABI7500荧光PCR仪，实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃，5min；预变性94℃，3min；94℃，15s，55℃，1min，40个循环。