[发明专利]PKCα-siRNA质粒载体的构建、筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种PKCα-siRNA质粒载体的的构建、筛选方法及其应用。

背景技术

化疗是继外科手术外治疗肿瘤的主要有效手段。不幸地是，多药耐药（multidrug resistance, MDR）的产生严重影响了化疗效果。因此，如何逆转肿瘤的多药耐药已成为目前肿瘤治疗研究的重点。

蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)是一种磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，在细胞内信号传导中起重要作用。PKC是一类同工酶家族，它们经生长因子、激素及神经转化因子作用后发生磷酸化或活化。其中，蛋白激酶C同工酶-α（PKC-α）广泛存在于各种组织中，具有维持细胞增殖与凋亡之间平衡的作用。在许多转化细胞及肿瘤细胞中常常发现PKC-α的异常表达。PKC-α的表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力密切相关。近年来研究表明，PKC-α在肿瘤多药耐药机理上有着重要作用，PKC-α是MDR发生发展过程中的关键调节蛋白，可以作为癌症治疗的一个靶点。PKC-α的过度表达与MDR表型的高表达有着密切关系。PKC-α的活化可导致耐药蛋白P-gp170的磷酸化及细胞内药物浓度的下降，而抑制PKC的表达能部分逆转MDR表型。进一步研究发现，将PKC-α基因转染到MCF-7乳腺癌细胞中，发现MCF-7对多柔比星和长春新碱的耐药性得到提高。在临床上，肿瘤患者中PKC-α表达阳性者的化疗反应率明显低于阴性表达者，复发患者中PKC-α阳性表达率明显高于未复发的患者。

1998年,Fire等首次将正义链和反义链的RNA混合物——双链RNA注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强的多的基因沉默,他们将这种现象命名为RNA干扰(small RNAs mediating RNA interference, RNAi)，从而获得2006年诺贝尔奖。RNAi作为真核生物中普遍存在的一种自然现象,是利用双链RNA诱发宿主细胞同源mRNA降解,从而抑制特异目的基因表达的方法。随着RNAi的深入研究，RNAi已成为肿瘤研究中的一个热点，RNAi技术在癌基因及抑癌基因的敲除、肿瘤疾病信号传导途径以及肿瘤免疫逃逸等方面的研究都被广泛开展。而近来, RNAi技术在逆转肿瘤多药耐药方面的研究正成为当前肿瘤学研究热点之一。针对不同的耐药机制,设计不同的小分子干扰RNA（small interference RNA, SiRNA）来逆转肿瘤耐药,已经成为研究肿瘤耐药和肿瘤基因治疗的重要组成部分。目前，虽然有关沉默PKC-α基因的siRNA质粒载体尚有一些报道，但仍存在许多问题限制其应用和发展。例如：导入肿瘤耐药细胞的成功率不高；沉默PKC-α基因的siRNA质粒载体的特异性和灵敏度不够等，这对于基因调控逆转耐药的药物研发具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种PKCα-siRNA质粒载体的构建、筛选方法及其应用，以克服现有技术存在的上述不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种PKCα-siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，包括以下步骤：

1）设计及合成靶向PKCα的siRNA，进一步包括以下步骤：

1.1）根据基因库PKCα基因序列筛选出候选序列；

1.2）根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列；

1.3）确定靶向PKC-α的siRNA 的目标序列；

2）构建PKC-α siRNA的重组质粒载体，进一步包括以下步骤：

2.1）退火连接单链目的基因片段；

2.2）Eco31I酶切质粒pEGFP-iLenti；

2.3）1％琼脂糖凝胶回收酶切线性空载体；

2.4）连接线性化质粒载体；

2.5）重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增；

2.6）纯化重组质粒。

进一步的，步骤1.2）根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列，进一步包括以下步骤：

1.2.1）从转录本的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；

1.2.2）利用BLAST软件将候选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列或基因表达序列标签同源的候选序列；

1.2.3）选出合适的目标序列。

进一步的，步骤1.3）中确定的目标序列为：

5'-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3',