[发明专利]PKCα-siRNA质粒载体的构建、筛选方法及应用

权利要求书

1.一种PKCα-siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）设计及合成靶向PKCα的siRNA，进一步包括以下步骤：

1.1）根据基因库PKCα基因序列筛选出候选序列；

1.2）根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列；

1.3）确定靶向PKC-α的siRNA的目标序列；

2）构建PKC-α siRNA的重组质粒载体，进一步包括以下步骤：

2.1）退火连接单链目的基因片段；

2.2）Eco31I酶切质粒pEGFP-iLenti；

2.3）1％琼脂糖凝胶回收酶切线性空载体；

2.4）连接线性化质粒载体；

2.5）重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增；

2.6）纯化重组质粒。

2.根据权利要求1所述的PKCα-siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于：步骤1.2）根据RNAi目标序列的选取原则优化siRNA序列，进一步包括以下步骤：

1.2.1）从转录本的AUG起始密码开始，寻找AA二连序列，记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；

1.2.2）利用BLAST软件将候选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列或基因表达序列标签同源的候选序列；

1.2.3）选出合适的目标序列。

3.根据权利要求2所述的PKCα-siRNA质粒载体的构建及其筛选方法，其特征在于：步骤1.3）中确定的目标序列为：

5'-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3',

5'-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3',

5'-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3',

5'-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3'。

4.权利要求1-3任一项所述的构建及其筛选方法获得的PKCα-siRNA 492质粒载体逆转肿瘤耐药表型的用途。

5.权利要求1-3任一项所述的构建及其筛选方法方法获得的PKCα-siRNA 492质粒载体提高肿瘤耐药细胞株的药物敏感性的用途。