[发明专利]一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法。

背景技术

研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组时代研究的主题之一。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是人类基因组中最常见的单碱基差异，在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个人对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。SNP的广泛应用前景，使之成为了后基因组时代的主要研究内容之一。

由结核分支杆菌引起的结核病是当今全球流行最广泛的传染病之一。近年来结核疫情有重新上升的趋势，其主要原因之一就是耐多药结核的流行。因此，快速、准确的实现结核耐药性检测将有助于从根本上控制结核的流行。

遗传学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变所造成。目前对结核杆菌耐药性分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。现已研究清楚耐药性是由相关基因的突变形成的，这些基因突变使得结核分枝杆菌对抗结核一线药物（利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素等）出现了耐药性，准确地检测出这些引起耐药性的突变位点，已经成为控制结核的关键问题之一。

基因突变常以单个核苷酸位点突变的形式出现，产生了单核苷酸多态性（SNP）。这些变异位点以较高的密度存在于结核分支杆菌的基因组中，从而对这些位点上核苷酸的检测成为编写相关基因图谱的有力工具。

目前已有许多检测基因多态性的方法，它们大多数都在含有目的聚核苷酸片段的反应混合物中，使用双脱氧核苷酸扩增出不同长度的扩增产物，将双脱氧核苷酸进行放射性同位素或荧光标记，然后通过检测扩增产物的长度、放射性或荧光值来对突变位点核苷酸进行测定，也可以通过严密控制条件的凝胶电泳来检测核酸内由于序列改变而引起的构象变化。

科学研究和临床应用上都亟需能同时进行简单、有效且低成本的高通量SNP分析技术。但总体来说，现有方法普遍受到样品纯化浓缩、操作复杂，及标记检测技术的限制，能同时检出的SNPs位点数和样本数是很有限的，有的方法分析成本过高或结果的准确性不够，缺乏真实的实用性。这些技术和方法上的瓶颈，妨碍了后基因组研究的深入方法。同时，高通量低消耗地跟踪细菌也需要进一步开发简单、有效且低成本的高通量SNP分析技术，以提高相应的检测效率。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种检测目标核苷酸序列中单核苷酸多态性SNP位点或者点突变的方法，所述目标核苷酸序列的3’端与待测位点处核苷酸紧邻的核苷酸序列已知，该方法包括以下步骤：

1、使所述目标核苷酸序列与一条作为延伸引物的寡聚核苷酸序列杂交，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸的序列与目标核苷酸中待测位点的3’端下游序列互补。因此，这个作为延伸引物的寡聚核苷酸序列的3’端位点处核苷酸与目标核苷酸序列中待测位点处核苷酸的3’端紧邻的核苷酸也互补。

2、在反应混合物中，提供与待测位点处核苷酸具有互补碱基的被标记的dNTP。

3、在反应混合物中，相应的聚合酶在适当的条件下将与待测位点处核苷酸互补的被标记的dNTP连接到延伸引物上。

4、对延伸后的引物进行荧光偏振光值（即FP值）测定，分析所得数据，获得所检测的SNP或点突变的相关信息。