[发明专利]一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及从重组工程菌中提取重组耐热聚合酶的方法，具体地，涉及了一种从重组大肠杆菌微波辅助提取重组耐热Pfu DNA聚合酶的方法。 

背景技术

DNA聚合酶（DNA polymerase），是细胞DNA复制的重要酶，主要应用在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)中。DNA聚合酶主要分为六个类型：A、B、C、D、X、Y，通常所用的属于B型聚合酶。Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furiosis中提取的耐高温DNA聚合酶，是保真性最好的聚合酶之一。 

最初使用的Pfu DNA聚合酶直接从菌体中分离纯化，但难以得到大量的酶，后来的研究者将其基因重组到其它宿主细胞中得以表达，再经提取纯化即可满足应用要求。根据现有文献所述，Pfu DNA聚合酶的提取一般需要两个步骤，第一个步骤为破壁，将得到的重组菌体用超声、溶菌酶等方法或者两种方法结合来破碎细胞壁，此步骤需要冰浴低温，防止酶变性失活。第二个步骤为热变性，将破碎后的细胞或将破碎后的细胞离心取上清液置于75-80℃的水浴中20-30min，利用聚合酶的耐热性，去除其余大部分不耐热杂质蛋白，减小后续纯化分离的杂质干扰，这也是其它重组耐热DNA聚合酶的常用的提取方法。Dabrowski等人(Dabrowski et al.,Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei,Protein expression and purification,1998,14(1):131–138)提取重组Pfu DNA聚合酶时，将所得菌体超声破碎，离心后上清液于75℃水浴30min，再次离心获取上清液即为粗提液。吴海洪等(吴海洪等乳糖诱导Pfu DNA 聚合酶基因的表达及酶的纯化,科技通报,2008,24(1):23-28)在菌体加入缓冲液、PMSF和溶菌酶，之后超声波破碎。离心后上清液75℃水浴20min再次离心可得粗酶液。Kim等人（Kim et al.,Crystal structure of Pfu,the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus,International Journal of Biological Macromolecules,2008,42(4):356-361.）在菌体中加入Tris-HCl缓冲液，置于冰上超声，超声后立即75℃加热30min，在4℃离心即得粗酶液。从现有提取技术可看出，重组细胞破碎后需要再次转移到新的仪器中进行热变性，提取步骤较为繁琐，而且超声破碎处理量较小，规模化放大不易实现。