[发明专利]一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法，其特征在于，包括： 

（1）向重组表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液和助提剂，使菌体细胞分散均匀； 

（2）将步骤（1）所得混合液置于功率为200～1000W的微波场中进行提取，提取期间使混合液温度保持在70～95℃的温度范围。 

2.根据权利要求1所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（1）中，按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1：（10～40）、优选为1：（15～30）、进一步优选为1：（18～25）加入所述缓冲液。 

3.根据权利要求1或2所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液； 

优选地，所述缓冲液的pH值为6.0～9.0，进一步优选为6.5～8.5，更进一步优选为7.0～8.0； 

优选地，所述缓冲液中的离子浓度为0.01～0.08mol·L^-1，进一步优选为0.02～0.06mol·L^-1，更进一步优选为0.03～0.04mol·L^-1。 

4.根据权利要求1-3任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（1）所述助提剂为表面活性剂，优选为Triton X-100、Tween20、Tween80、SDS、Span、LAS、PEG、CPB或BAB； 

优选地，所述助提剂为非离子型表面活性剂，进一步优选为Triton X-100、Tween20或Tween80； 

优选地，按g/mL计的质量体积百分比，所述助提剂的添加终浓度为 0.2～1.5%，进一步优选为0.4～1.2%，更进一步优选为0.6～1.0%。 

5.根据权利要求1-4任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（2）所述微波场的频率为2450MHz； 

优选地，所述微波场的功率为300～800W，进一步优选为400～600W。 

6.根据权利要求1-5任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（2）所述提取期间，通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70～95℃、优选为75～90℃、进一步优选为80～85℃的温度范围。 

7.根据权利要求1-6任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（2）所述提取时间为5～30min，优选为10～25min，进一步优选为15～20min。 

8.根据权利要求1-7任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤（2）所述提取期间，保持搅拌所述混合液； 

优选地，所述搅拌为磁力搅拌； 

优选地，所述搅拌转速为100～800rpm，进一步优选为200～600rpm，更进一步优选为300～400rpm。 

9.根据权利要求1-8任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，还包括将步骤（2）所得提取液进行离心、取上清的步骤； 

优选地，所述离心为在0～4℃、优选4℃，以8000～15000rpm、优选10000～12000rpm的转速离心10～30分钟。.

10.根据权利要求1-9任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，包括如下步骤： 

（1）按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的质量体积比为1：（10～40）、优选为1：（15～30）、进一步优选为1：（18～25），向重组表达Pfu DNA聚合 酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液；再加入助提剂使其以g/mL计的质量体积百分浓度为0.2～1.5%、优选为0.4～1.2%、进一步优选为0.6～1.0%，振荡使菌体细胞分散均匀； 

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的pH值为6.0～9.0，优选为6.5～8.5，进一步优选为7.0～8.0；所述缓冲液中的离子浓度为0.01～0.08mol·L^-1，优选为0.02～0.06mol·L^-1，进一步优选为0.03～0.04mol·L^-1； 

所述助提剂为表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选为Triton X-100、Tween20或Tween80； 

（2）在转速为100～800rpm、优选200～600rpm、进一步优选300～400rpm的搅拌下，将步骤（1）所得混合液置于频率为2450MHz、功率为200～1000W、优选为300～800W、进一步优选为400～600W的微波场中进行提取，提取期间通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70～95℃的温度范围、优选在80～85℃的温度范围内，提取时间为5～30min、优选为10～25min、进一步优选为15～20min； 

（3）将步骤（2）所得提取液冰浴冷却后，在0～4℃、优选4℃，以8000～15000rpm、优选10000～12000rpm的转速离心10～30分钟，即得含有Pfu DNA聚合酶的上清液。