[发明专利]改进复合基质中微生物的分析的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月13日提交的美国临时专利申请号61/779,766的申请日的权益，并且涉及2012年4月5日提交的美国临时申请号61/620,823，其与本申请共同拥有，其公开内容通过引用由此并入本文。

发明背景

确定特定样品中活的生物的同一性和总数目是非常重要的。其具体的重要性是通过快速、高效和准确地监控和鉴定食物中和环境中的致病生物，进而监测和确保食物和水供应的安全。

实现此的一个这样的方法是总存活生物(TVO)测定(totalviabilityorganismassay)。TVO测定如今作为质量控制应用广泛用于工业微生物领域。例如，TVO测定用于监测消费食物产品比如肉中的细菌的数目和类型。TVO方法还可用于监测饮用水中的细菌群体。当然，监测食物和水对确保食物和水供应的安全消费是至关重要的。

TVO测定的步骤一般包括：1)获得试样；和2)在置于合适容器中的琼脂(凝胶状营养物质)上培养或平板接种。使微生物生长并基于在琼脂上形成的菌落的数目计算菌落形成单位(CFU)。仅可在为菌落生长留出时间后计算CFU。样品通常被稀释，并且当计算CFU时考虑此稀释因子(即，样品与总体积的体积比)。

还可以在各种琼脂平板上培养样品，所述琼脂平板包含不同类型的选择性培养基以帮助分离目标微生物，并且更精确和可靠地确定存在哪种类型的微生物。选择性试剂(例如，抗生素、抗真菌剂等)将消灭某些非目标微生物(例如，不感兴趣的细菌)。这避免了如果形成来自许多不同类型的微生物的菌落可能出现的假结果的可能性。

选择性试剂还可以相对于其它类型利于某些类型的微生物的生长。虽然TVO测定允许检测不同的微生物物种，例如不同的细菌物种，但是食品和环境微生物学家通常必须在计数和鉴定之间选择，而不能选择二者。虽然选择性试剂可被添加以利于特定类群生物的生长，但是TVO测定通常基于正常健康细胞在富营养培养基中繁殖的能力(即，不进行选择)。因此，TVO具有测量待测样品中的微生物或一类群微生物的总数目的能力。然而，因为缺少区分特定微生物的能力，TVO对作为整体的微生物群体可以是相对非特异性的。

存在鉴定特定微生物，尤其是病原体的可用的众多其它方法。这样的方法广泛地用于临床环境。用于检测微生物的方法通常取决于微生物培养的富集以增大目标微生物的数目和允许回生损伤的微生物。当采用选择性和鉴别平板接种时，研究者能够将目标生物与背景微生物群落区分开。然而，结果几乎总是非计数性的。换句话说，仅可以确定特定细菌群体的存在与否，而不能定量。

利用样品富集和选择性平板接种结果二者是耗时的测定，其通常甚至在可获得初步结果前花费数天。虽然这样的富集和选择性平板接种是确定样品中微生物的数目和类型的主要过程，但是它通常可花费数天以在对琼脂上生长的菌落计数后获得最终结果。获得结果所花费的时间量是使用主要的TVO测定的最显著的缺点。

已经开发了不同的方法，其试图通过消除选择性和鉴别平板接种步骤缩短检测时间。这样的方法包括DNA杂交、凝集和酶免疫测定。虽然这些可选技术已经缩短了检测时间，但是培养富集步骤依然必要，因为这些方法仅允许10³-10⁴CFU的目标病原体的最终检测。因此，假定阳性结果的确认依然需要TVO测定。

此外，不存在可用于分析生物样品，尤其是食物样品的通用方法或单个技术，以检测多种微生物存在与否。这使得在测定微生物之前用于分离和随后浓缩来自生物样品的微生物的样品制备步骤成为用于检测病原体的分子方法中的限速步骤，所述病原体包括食物传染的病原体。

对于分离微生物的具体样品制备技术，利用离心然后是冲洗和过滤步骤的技术是没有优势的，因为它们在处理期间导致微生物的显著损失或损伤微生物。此外，整个过程是不可以是自动化处理的。

为了实现从样品分离微生物，已经采用用于特定微生物的亲和试剂。然而，用于从复合基质分离微生物的亲和试剂也是复杂而难以运用的，因为：1)缺少结合至选择性地来自其它样品成分的所有生物的通用亲和试剂；2)不同生物结合至通用亲和试剂的亲和力可变性；和3)将结合的生物洗脱回溶液的困难。