[发明专利]用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原

说明书

本申请要求2012年10月12日提交的美国临时专利申请61/713,356的利益，为所有目的将其全部内容通过引用的方式合并入本文。

发明领域

本发明涉及包含无细胞百日咳抗原的稳定组合物，所述无细胞百日咳抗原没有用交联试剂例如甲醛或戊二醛进行交联，以及它们在组合疫苗中作为无细胞百日咳组分的用途。

背景

百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。疫苗中的百日咳抗原或者是细胞的(全细胞，以灭活的百日咳博德特氏菌细胞的形式；“wP”)，或者是无细胞的(“aP”)。细胞百日咳抗原的制备有详细记载(例如，参见参考文献1的第21章)，例如可以通过对百日咳博德特氏菌的I阶段培养物的加热灭活获得。无细胞百日咳抗原包含脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素，或“PT”)；(2)丝状血凝素(“FHA”)；和(3)百日咳杆菌粘附素(也被称为“69KD外膜蛋白”)。通常通过从在改良的Stainer-Scholte液体培养基中生长的百日咳博德特氏菌培养物中进行分离来制备这三种抗原。一些百日咳疫苗中另外包括百日咳博德特氏菌菌毛(例如凝集原2和3)。

PT和FHA可以从发酵液中分离 (例如通过羟基磷石灰凝胶吸附)，而百日咳杆菌粘附素可以通过加热处理和絮凝(例如使用氯化钡)从细胞中提取。然后在连续的层析和/或沉淀步骤中纯化抗原。可以通过疏水层析、亲和层析和尺寸排阻层析纯化PT和FHA。可以通过离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析纯化百日咳杆菌粘附素。

在将FHA和百日咳杆菌粘附素加入到疫苗制剂之前通常用甲醛作为交联剂对其进行处理。通常通过用交联剂例如甲醛或戊二醛处理来对PT进行脱毒。作为这种化学脱毒程序的一种替代选择，可以通过酶活性所必需的并且由此负责抗原毒性的氨基酸的取代来对PT进行基因脱毒[2]。但是，基因脱毒的PT可能是不稳定的，且当以液体形式储存时易于降解[3]，因此用低浓度的甲醛处理来使蛋白质稳定，而不影响其物理化学和免疫学指标[4]。

抗原与交联剂例如甲醛或戊二醛的交联是附加的处理步骤，其增加了制备疫苗相关的成本，并在整个生产方法中引入了附加变量。但是，安全考虑，特别是当从同一个百日咳博德特氏菌培养物中分离FHA和百日咳杆菌粘附素作为酶活性PT时，导致采纳这样的制备方法：在加入疫苗之前将所有百日咳博德特氏菌抗原组分灭活，优选通过甲醛处理来灭活。此外，认为甲醛处理有益于增加液体疫苗制剂中各个单个百日咳博德特氏菌抗原的稳定性。

现已发现，从携带有基因脱毒PT的编码基因的百日咳博德特氏菌菌株充分纯化基因脱毒的PT和其它百日咳博德特氏菌抗原，使得不需要对PT和其它百日咳博德特氏菌抗原进行化学交联。单独纯化的组分甚至在升高的温度下进行长期储存后(在37℃至少一个月)还保持稳定性和免疫原性，而无需用甲醛或其它交联剂进行处理。

发明简述

本发明提供安全的和具有免疫原性的疫苗组合物，其不再需要用交联剂处理百日咳博德特氏菌抗原。本发明的疫苗制剂可与包含无细胞百日咳组分的标准组合疫苗以相同的方式储存，而不会由于储存期间的抗原降解而导致丧失效力。具体而言，本发明涉及疫苗组合物，其包含至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。

本发明还涉及组合疫苗，其包含基因脱毒的百日咳毒素和一种或多种选自IPV、HBsAg和Hib的其它抗原，其特征在于基因脱毒的百日咳毒素未用交联剂进行处理。

在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含百日咳博德特氏菌抗原PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，其特征在于至少两种百日咳博德特氏菌抗原未用交联剂进行处理，条件是，如果PT未用交联剂处理，则PT是基因脱毒的百日咳毒素。

在另一个实施方案中，本发明涉及组合疫苗，其包含铝盐佐剂和至少两种未交联的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原选自PT、FHA和百日咳杆菌粘附素，条件是任何PT均是基因脱毒的。Al⁺⁺⁺浓度优选低于1 mg/ml。本发明的组合疫苗可以进一步包括一种或两种Toll样受体(TLR)激动剂，其可以被吸附至铝盐佐剂。例如，本发明的组合疫苗可以包括TLR4激动剂(例如3d-MPL)或TLR7激动剂(例如化合物T，见下文)，其通常被吸附至铝盐佐剂。