[发明专利]通过测序少量遗传物质的高通量基因分型

说明书

本发明提供一种用于分析以少量存在的靶核酸的方法。特别的是，该方法包括下列步骤：i.提供样品，其中靶核酸以少量存在，ii.通过如下方法生成所述靶核酸的简化代表性文库，所述方法包括：使所述靶核酸片段化；连接衔接子至所述片段；和选择所述衔接子‑连接片段的子集，iii.进行所述简化代表性文库的大规模平行测序，和iv.通过分析由所述测序获得的结果而鉴定在所述靶核酸中的变体。

技术领域

本发明涉及提供在含有少量靶核酸的样品，例如相对少的分析物，例如少数或单个细胞或者自由流动的肿瘤或胎儿核酸中，快速发现、验证和评估整个基因组中遗传变异或染色体异常的方法和系统，该整个基因组包括性染色体和/或线粒体基因组。

背景技术

人类基因组中遗传变异的最常见形式是一类已知为单核苷酸多态性(SNP)的遗传变异。SNP在许多研究中是连接序列变异和表型改变的重要标志物。因此，SNP的鉴定也被称为SNP分型，是在分子诊断中的重要工具，并且其目的是确定不同于参考序列的至少一个碱基的位置。基因分型是针对个体的等位基因鉴别的过程。基因型典型地是使用从数以千计的细胞中提取的DNA来鉴别的。

相对于使用从大量细胞中提取的DNA，最近，技术已经发展到允许少量分析物的高容量、低成本的全基因组基因分型，如单个细胞或有限量的细胞。由于可用DNA的小量(对于正常二倍体人细胞是～7pg或对于单倍体细胞是～3.3pg)，单个细胞或有限量细胞的SNP-和基因-分型是艰巨的任务。为了克服起始物质的这种小量，广泛的全基因组扩增(WGA)通常在进一步的下游分析之前实施。已经描述了不同的WGA方法，并且其基于多重置换扩增(MDA)(例如Genomiphi和Repli-G试剂盒)或基于PCR的全基因组扩增方法(例如GenomePlex)。在该扩增之后，通过作为本领域已知的基于“SNP芯片”微阵列的平台而实现成功的基因分型。这些平台需要基因组序列和变异性的大量的现有技术知识，并且一旦设计完成就是仅仅适用于那些目标可变核苷酸位点的。该方法引入实质性确认偏倚，并且固有地排除对稀有的或人群特异性的变体的检测或者其在高度不同的物种中的应用。

新型的测序技术通过高通量平行测序(即下一代测序或NGS)能够在全基因组水平评估数万个靶点的变体，高通量平行测序能够快速全基因组测序。NGS通常产生是传统的Sanger测序的几个数量级高的数据。为了检索来自NGS研究的SNP-和/或基因型数据，需要数据的广泛生物信息学/统计学解释，其中包括用于碱基检出和基因组比对的算法，随后是用于SNP鉴定和/或基因型判定的工具。除了全基因组扩增，部分基因组扩增(PGA)有时被优选用于促进某些目的DNA片段(例如基因或外显子的集合，线粒体基因组，等等)的富集。已经报道全基因组和靶向扩增策略与高通量大规模平行测序的效果相关。