[发明专利]测定实时PCR循环阈值的通用方法

说明书

背景

本公开总体涉及用于处理代表S形或生长曲线的数据的系统和方法，并且更具体地涉及用于确定实时聚合酶链式反应(PCR)扩增曲线中的特征性循环阈值(Ct)或弯头值(elbow value)或其他生长曲线中的弯头值的系统和方法。

聚合酶链式反应是用于酶促合成或扩增定义核酸序列的体外方法。所述反应通常使用两个寡核苷酸引物，其与相反链杂交且侧接待扩增的模板或目标DNA序列。引物的延伸由热稳定的DNA聚合酶催化。涉及模板变性、引物退火和由聚合酶延伸退火引物的重复系列的循环导致特定DNA片断的指数累积。荧光探针或标记通常用于过程中，以便于扩增过程的检测和定量。

具体而言，同质(homogeneous)且在扩增开始或物理采样反应用于分析后不需要添加试剂的荧光技术是有吸引力的。示例性同质技术使用定位目标区域的寡核苷酸引物和用于生成信号的荧光标记或染料。典型的基于PCR的方法使用具有两个相互作用的发色团的FRET寡核苷酸探针(相邻的杂交探针，TaqMan探针，分子信标，Scorpions)，只具有一个荧光团的单一寡核苷酸探针(G-猝灭探针，Crockett, A. O.和C. T. Wittwer, Anal. Biochem. 2001; 290:89-97和SimpleProbes, Idaho Technology)，和使用dsDNA染料(例如，SYBR Green I)取代共价的、荧光标记的寡核苷酸探针的技术。PCR中结合所有双链(ds)DNA的DNA结合染料引起结合后染料的荧光。因此，PCR过程中DNA产物的增加因此导致荧光强度的增加，并且在每个循环测量，从而允许DNA浓度得到定量。然而，一个潜在的缺点是与所有dsDNA PCR产物的非特异性结合，这影响精确定量。关于标准稀释，PCR中的dsDNA浓度可以得到测定。

荧光报道探针只检测特异性探针结合的DNA序列，因此显著增加特异性。这允许定量扩增物，甚至在非特异性DNA扩增存在的情况下。为了在相同反应中检测多个目标，荧光探针可以用于多重测定中，其中具有不同颜色标记的特异性探针用于每个目标。荧光报道探针的特异性还防止引物二聚体引起的测量干扰，所述引物二聚体是在扩增过程中不期望的副产物。大多数应用基于荧光报道化合物和结合探针的荧光猝灭剂的相互作用。只要报道分子和猝灭剂化合物密切靠近，则在用激发源(例如，激光，LED等)激发后只有基础荧光可以检测到。一旦扩增发生，则报道分子和猝灭剂化合物的相互作用受到破坏，导致可检测的荧光信号。在每个PCR循环扩增的产物的增加导致荧光的成比例增加，这是由于报道分子和猝灭剂化合物的相互作用减弱。通常，在每个扩增循环中检测和测量荧光，并且其对应于产物的指数增加的几何增加用于测定每个反应中的阈值循环(CT)。

典型的动态PCR曲线显示于图1A中，其中绘制了典型PCR过程的荧光强度值相对于循环数。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监测PCR产物的形成。扩增通常在热循环仪中测量，其包括用于测量扩增反应过程中的荧光信号的组分和设备。此类热循环仪的一个实例是Roche Diagnostics LightCycler (目录号20110468)。扩增产物，例如，借助荧光标记的杂交探针(所述探针只有当结合目标核酸时才发射荧光信号)来检测，或者在某些情况下还借助结合双链DNA的荧光染料来检测。

对于典型的PCR曲线，鉴定在基线区域末端的转变点(其通常被称为弯头值或循环阈值(Ct)值)对于理解PCR扩增过程的特征极为有用。Ct值可用作PCR过程的效率的量度。例如，通常对于待分析的所有反应测定定义信号阈值，并且对于目标核酸以及对于参考核酸诸如标准或持家基因测定达到该阈值所需的循环数(Ct)。目标分子(起始材料)的绝对或相对拷贝数可以基于对于目标核酸和参考核酸获得的Ct值进行测定(Gibson等人, Genome Research 6:995-1001; Bieche等人, Cancer Research 59:2759-2765, 1999; WO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。图1A中在基线区域15末端的弯头值20将在循环数30的区域内。

RNA或DNA的量可以通过将结果与已知量的RNA或DNA的连续稀释物的实时PCR产生的标准曲线进行比较来测定。聚合酶链式反应(PCR)扩增中目标分子的绝对或相对拷贝数可以通过将循环阈值(Ct)值与标准曲线、与参考核酸的循环阈值(Ct)值或与绝对定量的标准核酸进行比较来测定。此外，聚合酶链式反应(PCR)扩增的效率可以通过将待分析的每个反应的循环阈值(Ct)与参考核酸的循环阈值(Ct)进行比较来测定。