[发明专利]粟酒裂殖酵母突变体的转化体、以及克隆载体

说明书

技术领域

本发明涉及具有无性絮凝性，可生产β-葡糖苷酶的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)突变体的转化体，以及对裂殖酵母属酵母的转化有用的载体。

背景技术

为了由木材、稻草、稻壳、杂草等纤维素类生物质生产作为发酵原料的糖，进而生产生物乙醇等生物质燃料，需要对作为植物细胞壁的主要构成成分的纤维素进行分解。纤维素的分解有浓硫酸糖化法、稀硫酸糖化法等酸糖化法，利用酶的酶糖化法等方法，在近年来生物技术的兴盛的背景下，进行了大量酶糖化法的研究开发。

纤维素的酶糖化利用总称为纤维素酶的一类酶。首先，具有随机切割纤维素链的活性的内切葡聚糖酶(EG)分解纤维素的非结晶区域，使葡萄糖末端暴露。利用纤维二糖水解酶(CBH)分解暴露的葡萄糖末端，使纤维二糖游离。接着，利用β-葡糖苷酶(BGL)分解游离的纤维二糖，从而使葡萄糖游离。

由于可生产用于分解、糖化结晶纤维素的各种纤维素酶以及半纤维素酶，且可将这些酶大量分泌至细胞外，因此纤维素的酶糖化广泛使用曲霉属、木霉属等的丝状真菌。

此外，也尝试了使这些丝状真菌的纤维素酶在异株中表达，非专利文献1中公开了通过编码作为丝状真菌的一种的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡糖苷酶I(BGLI)的基因来转化出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在得到的转化体中使这些酶表达。

但是，在酶糖化法的情况下，如果通过酶进行纤维素的水解反应，葡萄糖积蓄在反应体系内，则积蓄的葡萄糖抑制β-葡糖苷酶，纤维二糖积蓄，进而积蓄的纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，其结果是存在纤维素不能完全分解的问题。为此，希望β-葡糖苷酶的高功能化。

另一方面，与曲霉属以及木霉属相比，裂殖酵母属酵母的基因分析不断深入，确立了各种的有用的突变体以及基因导入用载体，有适合工业大量生产蛋白质的优点。但是，裂殖酵母属酵母不具有固有的β-葡糖苷酶基因，不能同化纤维二糖。本发明人用编码β-葡糖苷酶的基因转化裂殖酵母属酵母，在得到的转化体中使这些酶表达(专利文献1)。

另外，非专利文献1中，完全没有涉及出芽酵母所生产的β-葡糖苷酶的葡萄糖抑制。

另一方面，为了回收通过该转化体而分泌的β-葡糖苷酶，需要分离培养基上清和菌体的工序。作为分离工序，可例举离心分离、连续离心分离、膜分离等工序，任一种均为繁杂的工序，需要大量的人力和时间。

进一步，随着β-葡糖苷酶的生产规模的扩大，不难预想该分离工序的繁杂性的增大。

与此相对，由于具有无性絮凝性(无性地进行絮凝的性质)的酵母可以容易地从培养结束后的培养液分离出絮凝的酵母菌体和培养液，因此在β-葡糖苷酶的生产中优选将具有无性絮凝性的酵母作为宿主。

作为具有无性絮凝性的酵母，已知出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中的FLO突变体。此外，在裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(以下也称粟酒裂殖酵母)中也报道了具有无性絮凝性的突变体(例如，参照专利文献2)。

而且另一方面，以粟酒裂殖酵母为首的裂殖酵母属酵母是与出芽酵母Saccharomyces cerevisiae在进化系统上完全不同的酵母。已知染色体结构、基因组复制机制、RNA剪接机制、转录机制、翻译后修饰等各机制与其它酵母差别较大，其一部分与动物细胞类似。因此被广泛用作真核生物的模型(参照非专利文献2)。

粟酒裂殖酵母由于其各种特征，因此被视作更接近高等动物细胞的单细胞真核生物，被认为是作为外源基因、尤其是来源于高等动物的基因的表达用宿主非常有用酵母。已知尤其适合来源于包括人类在内的动物细胞的基因的表达(参照专利文献3～9)。

为了将粟酒裂殖酵母作为宿主使来源于外源结构基因的蛋白质表达，通常需要促进编码该蛋白质的外源结构基因的转录的启动子。作为该启动子，有粟酒裂殖酵母本身具有的基因中的启动子，和其它生物或病毒所具有的启动子。