[发明专利]使用序列标签的序列确定方法

说明书

交叉引用

本申请要求2013年3月15日申请的美国专利申请序列号13/835,093的优先权，美国专利申请序列号13/835,093要求以下美国临时专利申请的优先权：2012年6月11日申请的序列号61/658,317、2012年12月17日申请的序列号61/738,277以及2013年3月11日申请的序列号61/776,647，它们每个的全文通过引用并入本文。本申请还要求全文通过引用并入本文的2013年5月30日申请的美国临时专利申请序列号61/829,054的优先权。

发明背景

生物或医学样品的分析通常需要确定DNA和/或RNA的大的和复杂的群体的核酸序列，例如Gloor等，PLoS ONE 5(10)：el5406(2010)；Petrosino等，Clinical Chemistry,55(5):856-866(2009)；Arstila等，Science,286:958-961(1999)。尤其地，编码免疫分子，例如T细胞或B细胞受体或它们的组分的核酸谱包含大量的关于有机体的健康或疾病状态的信息，使得已经提出使用这样的谱作为许多健康状况的诊断或预后指标，例如Faham和Willis，美国专利公开2010/0151471；Freeman等，Genome Research,19：1817-1824(2009)；Boyd等，Sci.Transl.Med.,1(12):12ra23(2009)；He等，Oncotarget(2011年3月8日)。这样的基于序列的谱能够比基于扩增的靶核酸的大小分布、通过微阵列的序列取样、来自PCR扩增子的杂交动力曲线的方法或其它方法灵敏得多，例如Morley等，美国专利5,418,134；van Dongen等，Leukemia,17:2257-2317(2003)；Ogle等，Nucleic Acids Research,31:el39(2003)；Wang等，BMC Genomics,8:329(2007)；Baum等，Nature Methods,3(11):895-901(2006)。然而，因为待分析的群体的大小、这样的群体中序列的相似性、序列之间天然变异的有限可预测性以及由许多样品制备和测量步骤引入数据的噪音，从序列数据有效确定克隆型(clonotype)和克隆型谱(clonotype profile)构成挑战，例如Warren等，Genome Research,21(5):790-797(2011)。

序列标签或条形码已经以多种方式用于辅助核酸群体的分析，包括标记、污染监测、罕见突变检测、物理排序、分子计数等，例如Kinde等，Proc.Natl.Acad.Sci.,108(23):9530-9535(2011)；Casbon等,美国专利公开2012/0071331；Brenner,美国专利5,635,400；Brenner和Macevicz，美国专利7,537,897；Brenner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Church等，欧洲专利公开0 303 459；Shoemaker等，Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等，欧洲专利公开0799897A1；Wallace,美国专利5,981,179。最近，Kinde等(以上引用)显示了序列标签如何能用于区分测序和扩增错误与参照序列中的罕见突变。

考虑到用于医疗和诊断应用的准确测序的重要性，如果序列标签的使用可以就提高序列确定的效率和准确性而在这类应用中扩展，那么它将高度有益。

发明概述

本发明涉及用于产生复杂的核酸群体的基于序列的谱的方法，所述复杂的核酸群体特别是编码免疫分子或其部分的组库(repertoire)的重组核酸群体。在许多实施方式和应用中示例了本发明，它们的一些总结于以下并遍及说明书中。

在一个方面，本发明涉及确定免疫组库的克隆型的方法，所述方法包括步骤：(a)从个体获得包含T细胞和/或B细胞的样品；(b)将序列标签附接到T细胞受体基因或者T细胞和/或B细胞的免疫球蛋白基因的重组核酸的分子，以形成标签-分子轭合物，其中所述标签-分子轭合物的基本上每个分子具有独特的序列标签；(c)扩增所述标签-分子轭合物；(d)测序所述标签-分子轭合物；以及(e)比对相似序列标签的序列读段(read)以确定相应于所述组库的相同克隆型的序列读段。