[发明专利]缺氧诱导因子(HIF)活性报告细胞系

权利要求书

1.一种基因构建体，其结合有受缺氧诱导因子(HIF)应答启动子控制的报告基因，其中所述HIF应答启动子包括至少一个衍生自促红细胞生成素(EPO)基因的低氧应答元件(HRE)。

2.根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述启动子包含至少4个HRE，优选为串联重复，最优选地，其中所述启动子位于报告基因的上游。

3.根据权利要求1或2的基因构建体，其中HRE衍生自人类EPO。

4.根据权利要求1至3中的任一项的基因构建体，其中所述报告基因选自萤光素酶、荧光蛋白或能催化化学反应的酶，优选地，其中所述报告基因是萤火虫荧光素酶。

5.根据权利要求1至4中的任一项的基因构建体，其中，所述构建体包含如在人类EPO中发现的HRE序列的HRE。

6.一种载体，包含权利要求1至5中任一项所述的基因构建体。

7.一种细胞系，其包含根据权利要求1至5中的任一项所述的基因构建体或根据权利要求6所述的载体。

8.根据权利要求7的细胞系，其中稳定整合了所述基因构建体。

9.根据权利要求7或8的细胞系，其中所述细胞系是一个骨肉瘤细胞系，优选其中所述细胞系是Saos-2细胞系。

10.一种用于在细胞中测定HIF应答的方法，包括以下步骤：

a.将根据权利要求1至5中任一项的基因构建体导入到所述细胞中，

b.在缺氧状态培养所述细胞，

c.可选的，在常氧下培养对照细胞，

d.其中，所述报告基因的表达与所述细胞中的HIF应答相对应。

11.根据权利要求10的方法，其中所述细胞是骨肉瘤细胞。

12.根据权利要求10或11的方法，其中，将所述基因构建体转导或转染到所述细胞中，优选的，其中所述的基因构建体稳定转导或转染到所述细胞中。

13.根据权利要求10至12中任一项的方法，其中缺氧是介于0和5％O₂，优选0.01至1.0％O₂，更优选介于0.01和0.3％O₂。

14.根据权利要求10至13中任一项的方法，其中常氧是介于5至21％O₂，优选为10至21％O₂，更优选10至20％O₂。

15.用于鉴别HIF应答调节剂的筛选方法，包括，执行根据权利要求10至14中的任一项所述方法，将所述细胞与被怀疑是HIF信号传导调节剂的化合物接触，其中，报告基因表达量相对于未经处理的对照的增加表明该化合物是HIF应答的激动剂，并且报告基因表达量相对于未经处理的对照的降低表明该化合物是HIF应答的拮抗剂。

16.利用根据权利要求15所述的方法获得的调节低氧应答的化合物。

17.用于测试细胞中的HIF应答的试剂盒，包含根据权利要求1至5中任一项的基因构建体或权利要求6的载体，或包含根据权利要求6至8中任一项的细胞，任选地附有用于实施HIF应答测试的使用说明书和/或缓冲剂。