[发明专利]应用MALDI‑TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法

说明书

本发明涉及应用MALDI-TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法。本发明的方法还可以对包含于样品中的所关注的化合物进行定量，用作侵染性真菌感染检测的标记。

酵母，例如白色念珠菌(C.albicans)常存在于健康人的黏膜中，而通常不引起特异性的疾病或症状。当身体虚弱时，所述的酵母增殖并进入血液系统，在这样的情况下会产生侵染性或全身感染(systemic infection)。就白色念珠菌而言，40％的念珠菌血症(念珠菌血症，一种由白色念珠菌引起的真菌血症)对人类是致命的。侵染性真菌疾病(IFD)或侵染性真菌感染是常见的严重性入院疾病。尽管可以有效地进行治疗，但治疗成本的攀升使得医院不堪重负，IFD的发病率也没有下降趋势。传统的真菌学方法(分离/鉴定)存在缺陷，这是由于常常没有办法无风险地接触患者感染部位取样。对于近乎一半的IFD病例，血液培养为阴性。所谓的分子生物学方法(PCR)未能解决上述的问题。此外，已证实，早期引入基于诊断的抗真菌治疗影响患者的存活率。在传统真菌学的之外的或替代性的方法中，应用检测患者血清中的循环聚糖(即，含于感染患者血清中的聚糖)的方法已被临床医生所接受。可利用商业性的免疫试验检测这些来自微生物细胞(microcetes)的细胞壁的聚糖或其前体。Candida Antigen试验可检测分别来自念珠菌属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)的甘露聚糖和半乳甘露聚糖(galactamannans)。这些，例如牌的市售生化试剂盒可检测常见于念珠菌属和曲霉属(Aspergillus)的葡聚糖。

上述两种类型的试剂盒均包含多种不同的试剂和内标。由于需要对每个批次构建校准曲线导致试剂消耗增加，尤其是对于需检测血清的情况。对校准(calibration)的需要有时可能导致因财务原因(由于试剂不足)使研究无法进行。例如，很难用确定九孔校准的应用，并且需占用技术人员半天的时间试验一个血清。这些试验还需要特定程序化的自动分析仪并具备信息系统，这些都使得应当对所提出的请求作出及时应答时，基于单个患者的紧急实际应用复杂化。

因此，所有这些试验都对时间和试剂有特别的要求。此外，它们还产生一定数量干扰诊断的假阳性结果。尤其是在葡聚糖生化测定中，其受到存在的血红蛋白(收集时产生的溶血(haemolysed)血清)，或有患IFD风险的患者中常见的代谢异常(如，高甘油三酯血症，存在胆红素或低蛋白血症)的干扰。

结果，有若干次报道了假阳性致使患者以真菌以外生物的多重感染而入院重症监护。检测P-D-葡聚糖中假阳性反应的机制类型未知，因为还没有从分子水平将在这些患者血清中循环的物质表征出来。由于存在假阳性结果，一些无需任何治疗的患者接受了抗真菌抗生素的治疗，使其在院时间延长。对于同样也存在的假阴性结果，被解释成细菌感染而非真菌感染，因此对患者施用抗细菌抗生素，导致患者受到伤害甚至致命。

此外，试剂盒应用来自鲎的血液，鲎日益稀有，且目前无法对其进行饲养。因此，所用的鲎都是从自然界捕获的。从鲎获取血样然后将其释放，但是被释放的鲎中有15％不能存活。

本发明的一个目的在于提供一种新的体外诊断侵染性真菌感染的方法。

另一目的在于提供上述的体外方法，其更加可靠，并特别是一种有助于避免上述的假阴性和假阳性的方法。

本发明涉及用于由病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外方法。根据其特征，所述方法包括：

-提供由哺乳动物获得的并含有蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖的生物液体样品；

-处理所述样品，用于提取所述多糖和/或寡糖和/或单糖；-利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖、寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物。

-推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。

本发明人的贡献之一是表明可以通过MALDI-TOF质谱分析法检测复杂的生物液体中，存在选自糖类，特别是多糖、寡糖和单糖的化合物，所述化合物来源于病源性微生物、而非来自宿主哺乳动物。