[发明专利]核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向

权利要求书

1.一种在小鼠胚胎干（ES）细胞中修饰基因组的靶基因座的方法，所述方法包括：

（a）引入所述小鼠胚胎干（ES）细胞：

（i）锌指核酸酶（ZFN），所述锌指核酸酶在基因组的靶基因座或其附近产生单链或双链断裂；和

（ii）大靶向载体（LTVEC），所述大靶向载体包含翼侧为上游同源臂和下游同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸的长度为5kb至30kb，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的总和是至少10kb，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度为5kb至200kb，并且其中所述LTVEC的长度范围为50kb至300kb；以及

（b）选择经靶向的小鼠胚胎干（ES）细胞，所述小鼠胚胎干（ES）细胞包含在所述基因组的靶基因座中的所述插入核酸，其中将所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座使得所述插入核酸取代所述基因组的靶基因座处的内源核酸序列，其中与单独使用LTVEC相比，联合使用所述LTVEC与所述ZFN使得靶向效率增加。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与单独使用LTVEC相比，所述LTVEC的靶向效率增加至少2倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述ZFN是表达构建体，所述表达构建体包含编码ZFN蛋白的核酸序列，并且其中所述核酸与在所述细胞中有活性的启动子可操作地连接。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述ZFN是编码ZFN蛋白的mRNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶试剂的靶序列位于所述基因组的靶基因座的内含子、外显子、启动子或增强子区中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含选择性表达盒。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含报告基因。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸含有条件型等位基因或翼侧为位点特异性重组靶序列的核酸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中将所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座使得在所述基因组的靶基因座缺失内源性基因。

10.根据权利要求1所述的方法，其中将所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座导致敲除、敲入、点突变、结构域交换、外显子交换、内含子交换、调节序列交换、基因交换或其组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含人源核酸序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含人疾病等位基因。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含编码人源免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列的基因组核酸序列。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含编码人源免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列的基因组核酸序列。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述基因组核酸序列包含未经重排的人源λ和/或к轻链可变区核酸序列。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述基因组核酸序列包含重排的人源λ和/或к轻链可变区核酸序列。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述插入核酸包含与免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接的未经重排的或重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列。