[发明专利]一种血小板标记物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血小板标记物及其制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

血小板是体内血栓形成的关键成分之一，在心血管疾病（增殖、血栓形成和血栓栓塞）、炎症和部分肿瘤等多种病理生理进程中扮演重要角色。

然而，长期以来一直缺乏血小板的标记物，导致临床上难以直接有效检测血小板的聚集部位和聚集程度，使得血栓类疾病的研究停滞不前，因此，急需寻找一种血小板的标记物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种血小板标记物及其制备方法。

本发明血小板标记物，它是连接有血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G PAMAM。

PAMAM：聚酰胺-胺型树枝状高分子，是一种高度枝化的球状单分散大分子，其分子结构中心由中心核、重复单元以及末端基团构成，具有高度的几何对称性，其中心核为乙二胺结构，以中心核为起始中心，由丙烯酸甲酯等原料在外面接枝，每完成反应增长一代（Generation，简称G），每增长一代末端氨基数目增长一倍，2～6G PAMAM表示第二代～第六代聚酰胺-胺型树枝状高分子。

本发明制备前述血小板标记物的方法，具体步骤为：将2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接，再用荧光分子标记，即得连接了血小板特异性抗体和荧光分子的2～6G PAMAM。

所述2～6GPAMAM是由下述方法制备的：取PAMAM，溶于甲醇中，加入甲醇钠，在氮气保护下逐滴加入丙烯酸甲酯，搅拌60～80h，蒸去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到黄色油状液体，即为2～6G PAMAM；其中，甲醇的用量为PAMAM的40～60倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.06～0.08倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2～2.3倍（v/w）。

优选地，所述甲醇的用量为PAMAM的50倍（v/w），甲醇钠用量为PAMAM的0.07倍（v/w）；丙烯酸甲酯的总用量为PAMAM的2.14倍（v/w）。

所述的血小板特异性抗体为抗CD41抗体。优选地，所述的抗CD41抗体为抗CD41单克隆抗体。

2～6G PAMAM与血小板特异性抗体连接的方法为：取2～6G PAMAM，在室温下，加入（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体，反应1.5～2.5小时，去除剩余试剂，再加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，反应0.5～1.5h，超过滤净化，即可；其中，2～6G PAMAM、（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比（v/w/w/w）为（30～50）：（0.18～0.20）：（0.003～0.005）：（0.18～0.20）。

优选地，所述2～6G PAMAM、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）与血小板特异性抗体的反应时间是2小时，加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺后的反应时间是1h；所述2～6G PAMAM、（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、血小板特异性抗体、N-乙基顺丁烯二酰亚胺与的用量比（v/w/w/w）为40：0.192：0.004：0.192。

所述荧光分子是波长为680nm的近红外光染料。

所述荧光分子标记的方法为：在2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物中，加入0.0005～0.0015倍重量（w/v）的荧光分子，暗光孵化0.5～1.5h，即可。优选地，所述荧光分子的用量为2～6G PAMAM和血小板特异性抗体连接产物的0.001倍（w/v）；所述暗光孵化时间为1h。

本发明血小板标记物的标记效果优良，可直接有效地鉴定血小板的聚集部位和聚集程度，进而检测临床血栓类疾病，同时，标记物的制备方法简单，成本低廉，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

说明书附图

图1 荧光显微镜显示标记的血小板，红色为本发明标记物标记的血小板

具体实施方式

名词解释：