[发明专利]一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒。

背景技术

罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50％，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。2009 ~2013年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”。该病发病率一般达20％～30％，死亡率在95％以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。

无乳链球菌是罗非鱼链球菌病最主要的病原菌，在养殖过程中定期检测罗非鱼是否受到无乳链球菌的感染，是预防链球菌病的一种有效措施。目前已公开的专利和论文中，有使用分子诊断方法检测无乳链球菌的报道，这些方法虽然能够特异性的检测无乳链球菌，但有明显的缺点：(1) 检出灵敏度低，多数情况只适用于纯培养后菌体的检测，无法做到免培养检测；(2) 部分灵敏度高的检测方法，如LAMP法，只能定性判断出罗非鱼是否感染无乳链球菌，而对于感染程度，即罗非鱼体内无乳链球菌的含量无法进行检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，解决了上述现有技术的不足之处。

解决上述技术问题的技术方案是：一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E；

所述的试剂A的组成成分为：引物P1s 0.4 μM；引物P1a 0.4 μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl₂ 3mM；KCl 100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温20 0.005%；甘油0.5%；

所述的试剂B的组成成分为：引物P2s 0.4 μM；引物P2a 0.4 μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl₂ 3mM；KCl 100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温20 0.005%；甘油0.5%；

所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5%；

所述的试剂D为去离子水；

所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×10⁸拷贝/ml；

所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’- TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物P1a的序列为5’- CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’；

所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’- ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3’，引物P2a的序列为5’- CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3’。

由于采用上述技术方案，本发明之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，具有以下有益效果：

针对上述现有技术的情况，本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量的检测试剂盒。该试剂盒利用巢式PCR的方法对无乳链球菌特异基因cfb基因进行检测，大大提高了检测灵敏度。配合试剂盒中的血液抗凝剂，可不通过纯培养，以罗非鱼的血液为模板直接对无乳链球菌进行检测。对照标准反应结果，即可判断罗非鱼血液内无乳链球菌的含量。该方法可不通过纯培养而特异、快速检测罗非鱼血液是否携带无乳链球菌，并且可实现半定量检测，从而判断罗非鱼感染无乳链球菌的程度，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。

具体实施方式

一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、产品说明书和试验结果记录卡；